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为什么膜蛋白不能盐析沉淀
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请问大牛，为什么膜蛋白的粗分离不能用盐析沉淀法啊？我搜索了各大浏览器，均没有发现用盐析发粗分膜蛋白的说法(大都用的超高速离心发)。小弟想知道其中原因何在？还是他们顾及到了后续的透析比较浪费非离子型去垢剂？ PS： 最近小弟在提取一种含颜色标记的蛋白， 而且并不知道它是属于膜蛋白还是浆蛋白，但通过下一个实验我觉得它可能是膜蛋白： 1）一开始按照可溶性蛋白的常规步骤（匀浆，盐析）来处理，但发现目标蛋白的得率不高（无论是匀浆后的上清还是盐析后的沉淀中） 2）后面我在匀浆液中加入了1% tritonX-100，发现目标蛋白的得率得到了可观的表现 3）但加入了1% tritonX-100的匀浆上清（10000g×20min，除去未破细胞和细胞大碎片，上同），加入硫酸铵将其饱和度调至30%后，发现，目标蛋白不是沉淀在管底，而是聚集并漂浮在液面上。(这个原因还不清楚，师兄说是变性了。莫非这就是盐析沉淀膜蛋白不行的原因？) 不慎感激！！！ [ Last edited by 任天青 on 2013-5-13 at 11:26 ] |
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ynkuaile
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【答案】应助回帖
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| 个人建议：1. 你加入1% 曲拉通，蛋白得率提高，其实并不能说明他是膜蛋白还是胞内蛋白。因为你提取步骤是匀浆……，并不能很好的使细胞膜破裂，加入表面活性剂，能进一步破坏细胞膜，所以能更多释放胞内蛋白，所以并不能说明是膜蛋白还是胞内蛋白。2. 膜蛋白没有去垢剂的溶解是提取不出来的，能提取的，那是膜相关蛋白或锚钉蛋白。3. 不用硫酸铵沉淀是因为膜蛋白不能沉淀，普通蛋白沉淀了之后可以再溶解，膜蛋白不能溶解了。因为膜蛋白在水中是不溶的，做膜蛋白要考虑如何增溶。4. 加入硫酸铵之后漂浮在液面上，个人觉得可能和曲拉通有关，高浓度的硫酸铵夺取水分子，使曲拉通聚集形成大的胶束。可能曲拉通包裹着你的蛋白或其他油脂，由于密度小，而漂浮在液面上。另外，加表面活性剂不用硫酸铵沉淀还有个原因。硫酸铵夺取蛋白表面与之结合的水分子，使蛋白内部疏水残基暴露，聚集沉淀下来，这时候要是有去垢剂的存在，去垢剂疏水部分会与蛋白质疏水残基相互作用，从而使蛋白质变性。但是由去垢剂作用的蛋白并不是大量聚集沉淀，而是由去垢剂将其分散，是分散的蛋白，并不会形成颗粒很大的沉淀，由于密度较硫酸铵溶液的小，所以漂浮在溶液上面。个人建议，仅供参考。 |
2楼2013-05-14 23:01:25
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
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wizardfan: 金币+5, 谢谢分析，以后常来 2013-05-16 07:22:55
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楼主！我关注这个话题很久了，看一直没有人给你回复，我就说点吧！其实我懂的也不多，只是大概知道点理论知识！希望能对你有用！！ 首先，膜蛋白纯化在学术界一直是比较困扰的问题！一般的纯化方法并不能获得你要的膜蛋白，可能比较困难！ 1. 由于膜蛋白的过表达可能对细胞有毒性， 2.在纯化时很难选择合适的溶解试剂，不同的去污剂，它的助溶效果都不一样！（与可溶性蛋白不同，膜蛋白具有单重或多重跨膜结构容易发生聚集，导致膜蛋白很难溶解。目前常用的方法就是去污剂进行膜蛋白的溶解。去污剂同时具有疏水和亲水区域，和膜蛋白可以形成膜蛋白-去污剂的复合物，从而可以进行进一步的纯化。） 先回答你的PS的问题，你开始的问题我会另起一楼！ 我不建议你用硫酸铵的方法来获取膜蛋白，可能正如楼上所说！ 1.建议你用水溶性的蛋白层析技术，他也是可以用于膜蛋白的纯化，例如IMAC的亲和层析，分子筛，离子交换！ 2.每步纯化都需要添加去污剂，所以很消耗去污剂！成功的关键在于1）.你去污剂种类的选择，不一定非选tritonX-100，其他的也试试！SDS,CHAPS and so on;2). 最佳pH的选择和盐浓度的选择，都会影响你膜蛋白纯化得到的纯度！ 3.why我要添加去污剂？因为去污剂它存在CMC（临界胶束浓度）！如果不懂，可以上网search一下！ 这一楼就这么多吧！多了可能你也不会看！ |
3楼2013-05-15 10:54:52
【答案】应助回帖
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任天青(wizardfan代发): 金币+40, 谢谢参与 2013-05-22 07:35:12
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1. 采用超速离心的方法，也是分布离心的！根据每种物质不同的沉降系数来采用不同的离心率，从而达到分离的效果！ 2. 为何后续的透析比较浪费非离子型去垢剂？因为透析的体积较大！所以你添加的非离子型去垢剂量就多！其实不一定非要选择非离子型去垢剂，非离子型去垢剂不一定是做好的选择，其他的种类去污剂也可试试！ 好吧，就这么多吧！希望对你有用！ |
4楼2013-05-15 11:12:11
ynkuaile
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wizardfan: 金币+5, 感谢进一步的分析 2013-05-16 08:02:42
任天青(wizardfan代发): 金币+40, 谢谢参与 2013-05-22 07:34:51
wizardfan: 金币+5, 感谢进一步的分析 2013-05-16 08:02:42
任天青(wizardfan代发): 金币+40, 谢谢参与 2013-05-22 07:34:51
| 你80个金币太诱人了，不得不让我再回复一下你的帖子。你说常规可溶蛋白提取，得率不高，加曲拉通得率提高。可以肯定的说你的蛋白不是膜蛋白，因为膜蛋白如果没有去垢剂的提取是提取不出来的。你的蛋白可能是胞内蛋白或膜相关蛋白或锚钉蛋白。既然你的蛋白用曲拉通能提取出来，那么我觉得可以这么往下做:1. 透析掉曲拉通，硫酸铵沉淀。2. 你硫酸铵沉淀的目的是浓缩目的蛋白，其他方式也可以达到此目的，比如超滤，提取液比较多的话，有大的超滤装置。当然，还是透析掉曲拉通的好。因为你不加曲拉通的时候蛋白能提取出一些，只是量少，说明没有曲拉通蛋白还是可溶的，所以我觉得透析掉曲拉通不会影响蛋白的溶解性。你试验中的漂浮在液面上的现象可以这么解释：蛋白溶解在1%的曲拉通中，曲拉通的疏水端会与蛋白表面的疏水部分相互作用。这个浓度下的曲拉通不会使蛋白变性。加入高浓度硫酸铵，硫酸铵竞争结合水分子，使得曲拉通胶束浓度变大。曲拉通聚集。此时曲拉通的浓度比1%要高。高浓度的曲拉通会使得蛋白质变性。变性的蛋白并不会聚集沉淀，变性后的蛋白在曲拉通的作用下变为单分散或者多分散，但不会聚集成更大的聚集体以沉淀下来。曲拉通亲水的头部与硫酸铵溶液液面作用，曲拉通蛋白溶液密度小，浮在溶液表面。膜蛋白是不会用硫酸铵沉淀的。原因很多，硫酸铵沉淀一般都要求蛋白的量比较多，而膜蛋白能提取出一点都很费劲，所以不会用硫酸铵沉淀这种方法，膜蛋白的表达也很烧钱，所以会选择直接亲和纯化。膜蛋白想要得到沉淀只需要将去垢剂的浓度降低即可，不需额外加入其它东西。您的蛋白不是膜蛋白，是胞内蛋白或者膜相关蛋白。加曲拉通能提高你的得率很可能是你破细胞不完全，因为你用的方法是匀浆，超声等等，破的不完全。没有曲拉通也能提取你的蛋白，证明曲拉通对蛋白的稳定性影响不大，可以在你提取出来之后将其除去在做下面试验。除去曲拉通除了透析等方法外，还可以在正常盐浓度下过疏水柱，蛋白不结合，去垢剂由于疏水端会与柱子相结合。给点金币吧，打字不容易。 |
5楼2013-05-15 17:04:11
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