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同一个蛋白诱导之后大小变小了，而且超声过后就没有了，这是什么情况？求指导！
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我最近在做蛋白诱导，可是同样一个蛋白，之前师姐做的时候很顺利，都能纯化出来，可是现在我发现我诱导之后蛋白比之前师姐诱导的变小了，不知道是什么情况？质粒做过酶切也测过序，都是正确的，有没有人知道这是什么情况，我该怎么办？快纠结死了~做了快两个月了，一直没进展。 我诱导之后（用箭头指示的）.png  师姐诱导之后（用箭头指示）.png  超声过后我诱导的蛋白就没有了.png |
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stevenshi021
新虫 (小有名气)
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2楼2013-05-10 11:14:18
3楼2013-05-10 13:23:13
【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+5, thanks for the detailed analysis 2013-05-11 00:05:59
wizardfan: 金币+2, BioEPI+1, 谢谢详细的分析，继续保持 2013-05-12 09:39:26
小孩5406: 金币+5, ★★★很有帮助, 很详细 2013-05-12 12:52:23
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楼主！我来说几点，希望能给你点建议： 1.同样的蛋白在不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶上，呈现的电泳图是不一样的；即使是同浓度的凝胶，不同的电泳条件，如有人喜欢恒压，而有人选择恒流，导致结果可能出现细微的差别。只要在准确分子量上下浮动不大，一般问题是不大的，那可能就是你的蛋白。 2.你的蛋白是有GST标签的吧？你可以利用GE的GST柱纯化，得到蛋白的纯度应该是挺高的，将得到的蛋白再做个western blotting。如果你还有HIS标签，可以建议你做HIS的western blotting，his的特异性可能GST的好些！而且GST的标签容易断裂，导致蛋白降解！ 3.如果你还不敢确定，你可以先跑个SDS-PAGE，染色后，切胶送Modi-tof，根据多肽质谱图来确定了！ 4.破碎，本人还是有点小经验的，与你分享下吧！ a.超声破碎整个过程需要在冰水混合物的冰浴上进行！水不要多也不要太少！ b.破碎前，加少量溶菌酶和核酸酶。溶菌酶可以减少破菌时间，核酸酶可以水解核酸。还可以加点还原剂，如果你的半胱氨酸较多的话；也可以加点蛋白酶抑制剂！ c.超生破碎参数要设置恰当，一般间隙需要是超声的2倍，建议选择6s间隙，和3s破碎！如果样品量少于100ml， 建议500W超声20min，大概就行了！溶液就澄清了，不会那么粘！！！如果浑浊，但不粘，可能是包涵体！ d.破碎时，温度要控制好！过10min，搅拌一下样品，不要使样液温度很高，碰一下烧杯壁就能感觉到！如果温度高，那就先暂停一下，等温度降低，并且确保在冰浴中！或者改变超声参数，改为10s间隙，5s破碎，全程20~25min！ f.破碎完的蛋白离心之后要立即纯化，因为破碎后，样液中可能有许多蛋白酶，长时间放置会降解蛋白！ 建议你一下：你破碎完之后的上清上样量上少点！太模糊了，不利于你观察！我看了一下，你那还是有点蛋白的！只是太模糊了，而且你也没过柱纯化！没起到富集的作用！ |
4楼2013-05-10 22:46:17
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