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不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
wizardfan: 金币+5, thanks for the detailed analysis 2013-05-11 00:05:59
wizardfan: 金币+2, BioEPI+1, 谢谢详细的分析,继续保持 2013-05-12 09:39:26
小孩5406: 金币+5, ★★★很有帮助, 很详细 2013-05-12 12:52:23
楼主!我来说几点,希望能给你点建议:
1.同样的蛋白在不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶上,呈现的电泳图是不一样的;即使是同浓度的凝胶,不同的电泳条件,如有人喜欢恒压,而有人选择恒流,导致结果可能出现细微的差别。只要在准确分子量上下浮动不大,一般问题是不大的,那可能就是你的蛋白。
2.你的蛋白是有GST标签的吧?你可以利用GE的GST柱纯化,得到蛋白的纯度应该是挺高的,将得到的蛋白再做个western blotting。如果你还有HIS标签,可以建议你做HIS的western blotting,his的特异性可能GST的好些!而且GST的标签容易断裂,导致蛋白降解!
3.如果你还不敢确定,你可以先跑个SDS-PAGE,染色后,切胶送Modi-tof,根据多肽质谱图来确定了!
4.破碎,本人还是有点小经验的,与你分享下吧!
a.超声破碎整个过程需要在冰水混合物的冰浴上进行!水不要多也不要太少!
b.破碎前,加少量溶菌酶和核酸酶。溶菌酶可以减少破菌时间,核酸酶可以水解核酸。还可以加点还原剂,如果你的半胱氨酸较多的话;也可以加点蛋白酶抑制剂!
c.超生破碎参数要设置恰当,一般间隙需要是超声的2倍,建议选择6s间隙,和3s破碎!如果样品量少于100ml,  建议500W超声20min,大概就行了!溶液就澄清了,不会那么粘!!!如果浑浊,但不粘,可能是包涵体!
d.破碎时,温度要控制好!过10min,搅拌一下样品,不要使样液温度很高,碰一下烧杯壁就能感觉到!如果温度高,那就先暂停一下,等温度降低,并且确保在冰浴中!或者改变超声参数,改为10s间隙,5s破碎,全程20~25min!
f.破碎完的蛋白离心之后要立即纯化,因为破碎后,样液中可能有许多蛋白酶,长时间放置会降解蛋白!

建议你一下:你破碎完之后的上清上样量上少点!太模糊了,不利于你观察!我看了一下,你那还是有点蛋白的!只是太模糊了,而且你也没过柱纯化!没起到富集的作用!
长得比我英俊的,没我有才华!有才华的,没我长得俊!
4楼2013-05-10 22:46:17
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