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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 同一个蛋白诱导之后大小变小了，而且超声过后就没有了，这是什么情况？求指导！
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小孩5406

新虫 (小有名气)

[求助] 同一个蛋白诱导之后大小变小了，而且超声过后就没有了，这是什么情况？求指导！

我最近在做蛋白诱导，可是同样一个蛋白，之前师姐做的时候很顺利，都能纯化出来，可是现在我发现我诱导之后蛋白比之前师姐诱导的变小了，不知道是什么情况？质粒做过酶切也测过序，都是正确的，有没有人知道这是什么情况，我该怎么办？快纠结死了~做了快两个月了，一直没进展。

我诱导之后（用箭头指示的）.png



师姐诱导之后（用箭头指示）.png



超声过后我诱导的蛋白就没有了.png
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1楼 2013-05-10 11:00:36
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回帖置顶 ( 共有1个 )

不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+5, thanks for the detailed analysis 2013-05-11 00:05:59
wizardfan: 金币+2, BioEPI+1, 谢谢详细的分析，继续保持 2013-05-12 09:39:26
小孩5406: 金币+5, ★★★很有帮助, 很详细 2013-05-12 12:52:23
楼主！我来说几点，希望能给你点建议：
1.同样的蛋白在不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶上，呈现的电泳图是不一样的；即使是同浓度的凝胶，不同的电泳条件，如有人喜欢恒压，而有人选择恒流，导致结果可能出现细微的差别。只要在准确分子量上下浮动不大，一般问题是不大的，那可能就是你的蛋白。
2.你的蛋白是有GST标签的吧？你可以利用GE的GST柱纯化，得到蛋白的纯度应该是挺高的，将得到的蛋白再做个western blotting。如果你还有HIS标签，可以建议你做HIS的western blotting，his的特异性可能GST的好些！而且GST的标签容易断裂，导致蛋白降解！
3.如果你还不敢确定，你可以先跑个SDS-PAGE，染色后，切胶送Modi-tof，根据多肽质谱图来确定了！
4.破碎，本人还是有点小经验的，与你分享下吧！
a.超声破碎整个过程需要在冰水混合物的冰浴上进行！水不要多也不要太少！
b.破碎前，加少量溶菌酶和核酸酶。溶菌酶可以减少破菌时间，核酸酶可以水解核酸。还可以加点还原剂，如果你的半胱氨酸较多的话；也可以加点蛋白酶抑制剂！
c.超生破碎参数要设置恰当，一般间隙需要是超声的2倍，建议选择6s间隙，和3s破碎！如果样品量少于100ml，  建议500W超声20min，大概就行了！溶液就澄清了，不会那么粘！！！如果浑浊，但不粘，可能是包涵体！
d.破碎时，温度要控制好！过10min，搅拌一下样品，不要使样液温度很高，碰一下烧杯壁就能感觉到！如果温度高，那就先暂停一下，等温度降低，并且确保在冰浴中！或者改变超声参数，改为10s间隙，5s破碎，全程20~25min！
f.破碎完的蛋白离心之后要立即纯化，因为破碎后，样液中可能有许多蛋白酶，长时间放置会降解蛋白！

建议你一下：你破碎完之后的上清上样量上少点！太模糊了，不利于你观察！我看了一下，你那还是有点蛋白的！只是太模糊了，而且你也没过柱纯化！没起到富集的作用！
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长得比我英俊的，没我有才华！有才华的，没我长得俊！
4楼2013-05-10 22:46:17
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普通回帖

stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, thanks for posting 2013-05-10 23:56:03
看胶你们诱导的蛋白大小不是一样吗（～５５ｋＤ），超生后不见了那是因为蛋白可溶性差，你在诱导表达时候可以减低温度，减低IPTG浓度使得细胞有足够时间去折叠，此外对含有什么disulfides bonds的蛋白可以使用那些稀奇古怪的宿主试试。问题阐述的稍微明朗一点我愿意更贴，因为到现在我没有完全理解你的问题。
祝好
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2楼2013-05-10 11:14:18
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小孩5406

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stevenshi021 at 2013-05-10 11:14:18
看胶你们诱导的蛋白大小不是一样吗（～５５ｋＤ），超生后不见了那是因为蛋白可溶性差，你在诱导表达时候可以减低温度，减低IPTG浓度使得细胞有足够时间去折叠，此外对含有什么disulfides bonds的蛋白可以使用那些稀 ...

按道理的话蛋白大小应该是56kd，应该是在55条带上面一点，现在明显可以看到我诱导之后蛋白位置低于55的条带。
那么我可以认为我诱导的蛋白跟师姐诱导的那个是一样的吗？因为我担心我现在诱导出来的不是想要的蛋白，所以后续的纯化才不顺利。
我现在的诱导条件是37℃，5h。IPTG浓度是0.5mM。载体是pGEX-5X-1,宿主是Escherichia coli BL21 cells。
超声的时候应该注意什么？
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3楼2013-05-10 13:23:13
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小孩5406

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 不转录的DNA at 2013-05-10 22:46:17
楼主！我来说几点，希望能给你点建议：
1.同样的蛋白在不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶上，呈现的电泳图是不一样的；即使是同浓度的凝胶，不同的电泳条件，如有人喜欢恒压，而有人选择恒流，导致结果可能出现细微的差别。 ...

你说的挺有道理的，我再去试试。谢谢哈~希望多多指导
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5楼2013-05-12 12:48:59
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小孩5406 at 2013-05-12 12:48:59
你说的挺有道理的，我再去试试。谢谢哈~希望多多指导...

不用谢！有什么疑问我会跟帖！
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长得比我英俊的，没我有才华！有才华的，没我长得俊！
6楼2013-05-12 12:56:01
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小孩5406

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 不转录的DNA at 2013-05-12 12:56:01
不用谢！有什么疑问我会跟帖！...

你说我能把宿主换成DH5α来诱导吗
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7楼2013-05-13 10:46:04
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 小孩5406 at 2013-05-13 10:46:04
你说我能把宿主换成DH5α来诱导吗...

DH5α和BL21各有优缺点吧！
我觉得DH5α更亲向于克隆方面的，因为它的转化效果比较好！
BL21更亲向于蛋白表达，因为他表达的蛋白稳定性更高点！且蛋白水解酶少一点吧！
以上是我个人观点，希望能给你点帮助！
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长得比我英俊的，没我有才华！有才华的，没我长得俊！
8楼2013-05-13 11:12:45
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小孩5406

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 不转录的DNA at 2013-05-13 11:12:45
DH5α和BL21各有优缺点吧！
我觉得DH5α更亲向于克隆方面的，因为它的转化效果比较好！
BL21更亲向于蛋白表达，因为他表达的蛋白稳定性更高点！且蛋白水解酶少一点吧！
以上是我个人观点，希望能给你点帮助！...

嗯，很有帮助，很感谢你！
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9楼2013-05-13 14:53:10
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 小孩5406 at 2013-05-13 14:53:10
嗯，很有帮助，很感谢你！...

不用谢！
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长得比我英俊的，没我有才华！有才华的，没我长得俊！
10楼2013-05-13 15:10:06
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