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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » TD-PCR做出来条带很多怎么办，求高人指点
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lyaikele

金虫 (小有名气)

[求助] TD-PCR做出来条带很多怎么办，求高人指点

本人新手，做微藻多样性的，最近开始做PCR，跟着一篇文献里的方法做。

文献里用的是TD-PCR，程序是这样说的“10 cycles of 94° for 15s，60 to 51° for 30s，72°for 2min。Followed by 25 cycles of 94° 15s，55°for 30 to 54s and 72° for 2min and final extension of 72° 7min”，如果我没理解错的话这句话的意思是前10个循环退火温度从60逐渐降到51，每个循环降1°，后25个循环退火温度为55°，但时间从30s逐渐增加到54s，每循环增加1s。

可是P出来的结果有很多条带，目的片段为1070bp，而跑胶跑出来有2000bp左右的，有1000bp左右的，还有900多bp左右的，而且那个1000多bp的跑出来也不齐，想请教前辈们有没有碰到过这种情况的，如何解决或者该往哪方面思考问题出在哪里。

引物是按文献合成的，Tm值分别为53.1和46，PCR体系也是按文献来的，用的酶也是同一公司的。
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1楼 2013-05-08 21:03:15
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lyaikele

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by DoRbIr at 2013-05-10 00:07:36
这个程序我有两个想不明白的地方。首先，前十个循环的作用是来增加特异性。那为什么最后一个循环的复性温度，要比后面正常扩增的复性温度还要低呢？这样本身就容易增加非特异性扩增啊。其次，为什么要增加复性时间啊 ...

我也曾经怀疑过他程序里的温度，但是觉的毕竟文章都有了应该是可行的吧，所以就照着他的程序做的。
我打算把温度提高一点，然后做个温度梯度看看效果先，
谢谢回帖！
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12楼2013-05-10 13:09:25
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
lyaikele(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-05-09 08:15:03
看上去是非特异的了(如果楼主用的模板和文献里一样的话), 引物特异性怎样? 可以加长么? 46C的那条Tm感觉低了.
如果必须用文献里的引物的话建议把温度升高吧.
另外72C 2min减少到40s, 这个时间搞定1k的产物绰绰有余.
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2楼2013-05-09 03:39:51
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德国工兵铲

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
非特异性条带多，你可以起始的退火温度调高点，从62、63、开始
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3楼2013-05-09 08:57:23
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lyaikele

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-09 03:39:51
看上去是非特异的了(如果楼主用的模板和文献里一样的话), 引物特异性怎样? 可以加长么? 46C的那条Tm感觉低了.
如果必须用文献里的引物的话建议把温度升高吧.
另外72C 2min减少到40s, 这个时间搞定1k的产物绰绰有 ...

引物是跟文献里一样的，特异性没有验证过，不过出来文章了应该不至于差吧。
另外，弱弱的问一下既然作者设置了这个温度应该也是经过摸索后的最佳温度，如果擅自提高温度即使是得到了条带就一定是目的条带吗？还有延长速度一般大概是1kb/1min，通常这个时间的设置都会有点富余，而且通过延长时间来强制限制片段大小结果可信吗？
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4楼2013-05-09 09:23:00
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