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畅言||琪语

新虫 (初入文坛)

[交流] 求助WB大师 已有5人参与

求助WB国手：我研一，做WB第一次显影蛋白分子量20 显影结果很清楚，就是背景很高。现在第二次重新提蛋白，重新上样电泳转膜恒流200mA 2小时  为什么显影不出结果啊。第三次同样什么都没有，但是每次β-actin 显影出来结果都很好。。。难道我连续两次没孵上抗体？
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1楼 2013-05-07 20:59:01
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feixiang1209

新虫 (初入文坛)
★ ★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-08 02:07:37
转膜转过了，下次可以试试少转一会，蛋白本身就小，时间2小时太长了
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2楼2013-05-07 21:02:33
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畅言||琪语

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by feixiang1209 at 2013-05-07 21:02:33
转膜转过了，下次可以试试少转一会，蛋白本身就小，时间2小时太长了

我第一次做是100V 2h  显影量特别多，只是换了台机子，我就恒流了 。我应该继续恒压。2好 可以不
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3楼2013-05-07 21:06:12
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feixiang1209

新虫 (初入文坛)
★
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3楼: Originally posted by 畅言||琪语 at 2013-05-07 21:06:12
我第一次做是100V 2h  显影量特别多，只是换了台机子，我就恒流了 。我应该继续恒压。2好 可以不...

100v?????你确定？？？？是半干转膜还湿转啊？
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4楼2013-05-07 21:27:53
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畅言||琪语

新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by feixiang1209 at 2013-05-07 21:27:53
100v?????你确定？？？？是半干转膜还湿转啊？...

湿转 100V  我确定 我们这边实验室都这样的
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5楼2013-05-07 22:06:32
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feixiang1209

新虫 (初入文坛)
★
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5楼: Originally posted by 畅言||琪语 at 2013-05-07 22:06:32
湿转 100V  我确定 我们这边实验室都这样的...

哦 我只做过半干的  不过你这种情况很有可能使因为转过了
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6楼2013-05-07 22:50:54
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emosgaogao

金虫 (小有名气)
★ ★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流经验！ 2013-05-08 02:08:03
100V湿转应该没问题，我们实验室也是这个实验条件，所以重新提取的蛋白和抗体的影响应该大些，建议楼主还是新配抗体尝试下，同时对于20KD左右的蛋白用12%或者15%的PAGE胶。
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忍得住诱惑，耐得住寂寞
7楼2013-05-07 23:27:49
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畅言||琪语

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by emosgaogao at 2013-05-07 23:27:49
100V湿转应该没问题，我们实验室也是这个实验条件，所以重新提取的蛋白和抗体的影响应该大些，建议楼主还是新配抗体尝试下，同时对于20KD左右的蛋白用12%或者15%的PAGE胶。

我是用12%的PAGE胶 也试过重新用新抗体但是还是没结果    今天换了一个新二抗  看能不能出结果
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8楼2013-05-08 19:11:02
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churchill87426

木虫 (正式写手)
★
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不知道LZ用多大孔径的膜？最好用0.2uM的膜。不然有可能转过。
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9楼2013-05-08 19:34:15
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畅言||琪语

新虫 (初入文坛)
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9楼: Originally posted by churchill87426 at 2013-05-08 19:34:15
不知道LZ用多大孔径的膜？最好用0.2uM的膜。不然有可能转过。

刚好用大于等于 20KD 的膜     但是上次也是用这个膜 的啊
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10楼2013-05-08 20:15:25
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