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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助WB大师
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emosgaogao

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by 畅言||琪语 at 2013-05-08 19:11:02
我是用12%的PAGE胶 也试过重新用新抗体但是还是没结果    今天换了一个新二抗  看能不能出结果...

这么想来应该问题不大，最坏的影响是水质太差影响了western，笑~楼主换个新的二抗，最好同时点个阳性对照，这样更好分析~
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忍得住诱惑，耐得住寂寞
11楼2013-05-08 20:19:25
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emosgaogao

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by 畅言||琪语 at 2013-05-08 19:11:02
我是用12%的PAGE胶 也试过重新用新抗体但是还是没结果    今天换了一个新二抗  看能不能出结果...

LZ最好能同时点一个阳性对照，这样可以分析是否是抗体引起的，转膜效果从最小的maker片段是否能清晰的呈现来初步判断。
祝你好运~
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忍得住诱惑，耐得住寂寞
12楼2013-05-08 20:23:42
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lofty23

禁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
13楼2013-05-09 00:45:12
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houchm0927

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
先说我自己做过的，检测的是植物蛋白，28kD左右，湿法转膜200mA恒流2h，没问题。倒是试过只转1.5h，当时结果是SDS-PAGE胶上都还残有显色marker，所以一直2h。个人觉得楼主转膜参数没问题。
我觉得WB没结果原因挺多的。取样时蛋白制备是否有问题，需要楼主确定下；转膜成功与否可以丽春红染色看下；第一次结果是否可靠，背景很高会不会是假阳性；一抗二抗来源，是否匹配（实验室有个老师最开都买错二抗了，汗）；一抗孵育过程有问题吗，时间、温度、方式，actin做得出来说明二抗孵育应该没问题。
个人觉得WB自转膜后，后续步骤挺难监测的，造成问题的原因很多，实验除了严谨细致，确保每一步行之有理，还要靠运气的。
楼主好运
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畅言||琪语
14楼2013-05-10 01:02:35
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畅言||琪语

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
14楼: Originally posted by houchm0927 at 2013-05-10 01:02:35
先说我自己做过的，检测的是植物蛋白，28kD左右，湿法转膜200mA恒流2h，没问题。倒是试过只转1.5h，当时结果是SDS-PAGE胶上都还残有显色marker，所以一直2h。个人觉得楼主转膜参数没问题。
我觉得WB没结果原因挺多 ...

好吧  懂了~~~
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15楼2013-05-12 18:27:50
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