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求助WB国手：我研一，做WB第一次显影蛋白分子量20 显影结果很清楚，就是背景很高。现在第二次重新提蛋白，重新上样电泳转膜恒流200mA 2小时 为什么显影不出结果啊。第三次同样什么都没有，但是每次β-actin 显影出来结果都很好。。。难道我连续两次没孵上抗体？ |
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houchm0927
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先说我自己做过的，检测的是植物蛋白，28kD左右，湿法转膜200mA恒流2h，没问题。倒是试过只转1.5h，当时结果是SDS-PAGE胶上都还残有显色marker，所以一直2h。个人觉得楼主转膜参数没问题。 我觉得WB没结果原因挺多的。取样时蛋白制备是否有问题，需要楼主确定下；转膜成功与否可以丽春红染色看下；第一次结果是否可靠，背景很高会不会是假阳性；一抗二抗来源，是否匹配（实验室有个老师最开都买错二抗了，汗）；一抗孵育过程有问题吗，时间、温度、方式，actin做得出来说明二抗孵育应该没问题。 个人觉得WB自转膜后，后续步骤挺难监测的，造成问题的原因很多，实验除了严谨细致，确保每一步行之有理，还要靠运气的。 楼主好运 |
畅言||琪语14楼2013-05-10 01:02:35
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