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我最近用SSR去扩增BAC文库怎么都没有目的扩增片段，求原因？
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| 最近用实验室的SSR引物去扩增实验室构建的BAC文库，可是没有目的条带的出现，过年以前扩增的结果比较好，但是到了年后就不好了，求大家给予帮助，找出原因，谢谢！ |
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凌波丽
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 真是大牛，膜拜ing 2013-04-21 18:23:22
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小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 真是大牛，膜拜ing 2013-04-21 18:23:22
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原因可能有很多，最重要一个就是PCR扩增的问题。 PCR反应的关键环节有（1）模板核酸的制备，（2）引物的质量与特异性，（3）酶的质量，（4）PCR循环条件和反应体积的改变。（5）镁离子的浓度寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：a.模板中含有杂蛋白质，b模板中含有Taq酶抑制剂，c模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，d在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚,e模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。 Taq酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。一般Mg2+离子浓度可以从1mmmol/L逐渐上升，到10mmmol/L就不要再高了，每次上升Mg2+离子浓度的梯度为1mmmol/L。 PCR循环条件和反应体积的改变：PCR循环25次也就差不多了，再往后可能扩增的专一性就不一定能保证了，高手除外。通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 引物：既然你过去都能成功，估计引物序列问题不大，但是要调整引物浓度和其与模板的结合温度。 总体上，最先检查模板质量和酶质量，再调Mg2+浓度，接着调引物浓度和其与模板的结合温度，再控制循环次数和反应体积，这些都不行，那就要重新设计引物。 |
2楼2013-04-21 12:05:39
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