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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于双向样品预处理还原和烷基化的问题！请大侠指点！谢谢！
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pdiudiu0214

铁虫 (小有名气)

[求助] 关于双向样品预处理还原和烷基化的问题！请大侠指点！谢谢！

各位大侠在做双向的时候样品预处理有还原和烷基化吗？如果用DTT和IAA的话用量是多少？如果跑17cm的胶第二项恒流的电流分别是多大？时间分别是多久？盐桥怎么搭？我们的水化和聚焦是连在一起的，是加完样把滤纸放铂丝上吗？谢谢各位大侠！
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pdiudiu0214

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1楼 2013-04-15 11:02:00
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pdiudiu0214

铁虫 (小有名气)
送红花一朵
谢谢!我做的是体液,电压能升上去但是聚焦效果不好。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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8楼2013-04-18 18:47:46
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
pdiudiu0214: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢！ 2013-04-16 10:50:19
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天 2013-04-16 11:08:06
"各位大侠在做双向的时候样品预处理有还原和烷基化吗？"还原二硫键倒是一般必须，烷基化一般不必用。如果用DTT话用量是10-100mmol/L.第二像SDS-PAGE接通电源后一般以100V，20mA，预电泳10-20min。正式电泳时间是样品迁移速度而定。
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2楼2013-04-15 15:17:13
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guxinhan123

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
pdiudiu0214: 金币+2, ★有帮助, 谢谢！ 2013-04-16 10:47:23
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-16 11:08:15
样品预处理不用做处理，水化液里有DTT，一向聚焦结束后两次平衡分别用ＤＴＴ和ＩＡＡ，ＤＴＴ浓度为１０ｍｌ平衡buffer0.1g，IAA１０ｍｌ平衡buffer0.25g,第二向我一般恒功率，1w/gel 过夜，早上起来加大功率，具体看迁移速度，关系不大。
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3楼2013-04-15 18:55:20
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pdiudiu0214

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-04-15 15:17:13
"各位大侠在做双向的时候样品预处理有还原和烷基化吗？"还原二硫键倒是一般必须，烷基化一般不必用。如果用DTT话用量是10-100mmol/L.第二像SDS-PAGE接通电源后一般以100V，20mA，预电泳10-20min。正式电泳 ...

我恒流一般是先10mA，30min，30mA到胶的底部，但是感觉所有蛋白点都在胶的中下方，我想问一下，低电流的时候是只要看到溴酚蓝的线已经移动到胶条下方就可以升压了，还是需要再等一段时间再升压？我的电流是不是有些大？
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4楼2013-04-16 10:46:00
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