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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 环境 » 交流探讨 » 纯化后的DNA在琼脂糖胶上跑不出来，克隆长不出菌落是什么原因
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345430706

金虫 (初入文坛)

[求助] 纯化后的DNA在琼脂糖胶上跑不出来，克隆长不出菌落是什么原因

我要做细菌的克隆测序，但在克隆一步长不出菌落，发现二次PCR胶回收纯化后的产物在琼脂糖胶上跑不出条带，这是什么原因呢？之前相同的感受态细胞有做出来过的。烦劳各位指点迷津啊！
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1楼 2013-04-15 08:59:13
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xiadongliang

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
stormxuhao: 金币+1, 积极回复 2013-04-23 09:22:37
是这样,如果你的PCR条带比较单一,那你采用直接过柱纯化就可以.不用切胶.
如果你的条带不单一,那就只能切胶了.切胶的时候,切下来的胶条不要太大,尽量下.另外,你的反应体系可以加大到50uL,这样回收后即使损失50%,剩余的量也足够你进行连接了.
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4楼2013-04-23 09:00:37
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xiadongliang

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
nickxiaotong: 金币+1, 感谢提供建议 欢迎常来环境版参与交流 2013-04-23 08:29:15
那是不是你PCR产物纯化的时候丢失了？

那你再重新做一下试试吧。
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2楼2013-04-22 16:28:34
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345430706

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiadongliang at 2013-04-22 16:28:34
那是不是你PCR产物纯化的时候丢失了？

那你再重新做一下试试吧。

我已经重做好多次了，实验室师姐们都成功过，一直也忽略掉是纯化的问题，后来做连接的对照都长出来了的，才回去找纯化的原因。我二次PCR后的长度在100-200bp之间，亮度也还可以，纯化试剂盒用的生工的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒。能不能介绍下您的经验啊
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3楼2013-04-22 20:22:40
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