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急求！！ACC脱氨酶活性测定问题？？
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是这样的~~~之前有师兄师姐分离出来的菌株测定出来是有ACC脱氨酶活性的，能很明显的看到颜色对比，但是后来老师让我重新测定的时候，同样的方法再怎么测都测不出来，我想求教一下哪位做过这个实验的大侠，这个实验中有什么要特别注意的地方吗？我已经做了不下5次了,都快崩溃了。我下面贴出我的实验过程。。。请大家指教一下。 酶活测定： Sample Text 供试菌株在5mLTSB 培养液中扩大培养2d后，8000 g ，4 ℃离心10min， Sample Text 重新悬浮于5mLDF 培养液，加入30uL0.5M的ACC母液，使得ACC终浓度为3.0mM（ACC在水溶液中不稳定，因此过滤除菌后，保存在-20°C环境下)，室温(21士1℃)振荡培养2 d 后，8000 g ，4 ℃离心10min收集菌体； Sample Text. 用0.1 mol L-1 Tris-HCI 缓冲液（pH=7.6）洗涤三次，重悬浮于600 μL 0.1 mol L-1 Tris-HCI 缓冲液（pH=8.0）中，加入 30 μL 甲苯并迅速振荡30 s 以破碎细胞，转移200 μL含甲苯的细胞提取物，加入20 μL 0.5 M ACC 充分混匀；同时做不添加ACC 的空白试验，30 ℃水育 15 min后，立即放置于冰浴环境中终止反应；另取200uL在半小时内完成蛋白测定（或放置于4°C环境下待测）； Sample Text 添加1 mL 0.56 mol L-1 HCl，简单涡旋后，16 000 g，室温下离心5 min，取 1 mL 悬浮液，加入800 μL 0.56 mol L-1 HCl 和300 μL 0.2%2，4-二硝基苯肼，充分混匀后30 ℃水育 30 min，加入 2 mL 2 mol L-1 NaOH，540 nm 测吸光度。 |
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