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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做Western如何一张膜同时做3个单抗，我知道剪膜，但总是剪不好，如何精确剪膜？？？
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缤纷惠儿

新虫 (初入文坛)

[求助] 做Western如何一张膜同时做3个单抗，我知道剪膜，但总是剪不好，如何精确剪膜？？？

做Western想同时做几个单抗，我们的方法是剪开FVDF膜，分别孵育不同的一抗，但是，即使有marker作为参考，还是剪不好，有时做不出来就经常怀疑是剪膜把蛋白减到别的部分上去了，求助各位大侠，你们是如何做的？？？
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吃亏是福，好人有好报
1楼 2013-04-10 22:17:57
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ssy7166

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 2013-04-11 08:13:09
方法1：如果你的蛋白很多，多跑几板胶，整张膜只上一个抗体，而且坚持用同一产品Marker同一浓度的分离胶,多做几次就能确定目的蛋白相对与marker的位置。

方法2：如果蛋白样不多时，整张膜先上一个最重要的抗体；发光后用strip buffer洗，然后再上第二种抗体，再洗；最后还可以再上一下内参。

多做WB慢慢就会有感觉了。
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2楼2013-04-10 23:10:08
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hellolin

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用丽春红染一下膜，看着条带见就是了。完了之后在用tbst把丽春红洗掉就可以了
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scienceguy
3楼2013-04-10 23:57:26
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用预染的marker分开要剪开的样品泳道，剪marker中间就可以了。
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4楼2013-04-11 02:17:20
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mitocam

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如上所说，剪marker中间。

如果还不想浪费marker和样品槽的话，转膜后连膜带胶一起切。
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5楼2013-04-11 03:19:34
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缤纷惠儿

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ssy7166 at 2013-04-10 23:10:08
方法1：如果你的蛋白很多，多跑几板胶，整张膜只上一个抗体，而且坚持用同一产品Marker同一浓度的分离胶,多做几次就能确定目的蛋白相对与marker的位置。

方法2：如果蛋白样不多时，整张膜先上一个最重要的抗体； ...

PVDF膜可以回收利用三次吗？如果整张膜只做一个抗体，想5×6cm2这么大的膜得用多少毫升的二抗稀释液啊？怎么感觉这样有些浪费呢
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吃亏是福，好人有好报
6楼2013-04-11 11:26:42
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缤纷惠儿

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hellolin at 2013-04-10 23:57:26
用丽春红染一下膜，看着条带见就是了。完了之后在用tbst把丽春红洗掉就可以了

恩恩，不知道丽春红贵不贵，担心老师不给买。貌似这样也是粗略的定位，那么多条带，比如60到80间的marker，如果相同时做64和73蛋白的单抗，怎样区分开，还是说没有更好的办法，只能做其中的一个蛋白抗体。
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吃亏是福，好人有好报
7楼2013-04-11 11:30:28
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

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在胶的两头都上marker这样你就不会剪错了，但有个弊端，两端都有Marker，是对称的，就要就你在操作过程中要时刻记住膜的正反面
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
8楼2013-04-11 13:37:37
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hellolin

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 缤纷惠儿 at 2013-04-11 11:30:28
恩恩，不知道丽春红贵不贵，担心老师不给买。貌似这样也是粗略的定位，那么多条带，比如60到80间的marker，如果相同时做64和73蛋白的单抗，怎样区分开，还是说没有更好的办法，只能做其中的一个蛋白抗体。...

一般我们只会顺着泳道剪，如果你想一块膜横着剪的话那就点marker吧，不过觉得没必要，还不如分开做
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scienceguy
9楼2013-04-11 16:03:44
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neverold

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 缤纷惠儿 at 2013-04-11 11:30:28
恩恩，不知道丽春红贵不贵，担心老师不给买。貌似这样也是粗略的定位，那么多条带，比如60到80间的marker，如果相同时做64和73蛋白的单抗，怎样区分开，还是说没有更好的办法，只能做其中的一个蛋白抗体。...

64kd的带和73KD的还想分开啊？
预染的marker也不完全准，只能粗略看看，老实分开做吧
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10楼2013-04-11 18:08:33
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