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haifaaini

银虫 (初入文坛)

[求助] PCR技术

最近一直做pcr,一直没有结果,我该怎么设计实验,来判定是体系的问题,还是程序的问题呢? 谢谢了
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710002191

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
haifaaini(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,鼓励应助,分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-11 08:12:05
新虫小说两句,应该有阳性对照吧,要是阳性对照也不出,那应该就有问题了,可以优化一下pcr条件,做梯度pcr看改变温度了会不会出现结果吧,你做的是流调吧,也有可能本来就是样品的感染率低吧
may
2楼2013-04-10 12:51:11
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shui_hanliu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
haifaaini(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天 2013-04-11 08:12:23
增加一个阳性对照,可以是你们同学能够做得出结果的实验,按你的体系一一加入,用它的退火温度,如果能出来,说明体系没问题,你应该考虑模板是否正确,退货温度是否合适,还有引物没设计错吧

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3楼2013-04-10 13:00:55
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yujitianqing

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
haifaaini(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,鼓励应助,分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-11 08:12:34
一般是退火温度、引物或者是模板出问题。
退火温度出问题,可能使引物无法结合或错误结合;引物如果没设计好,可能出现二聚体;模板可能出现断裂……
你逐一检查下……

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4楼2013-04-10 13:26:39
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haifaaini

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 710002191 at 2013-04-10 12:51:11
新虫小说两句,应该有阳性对照吧,要是阳性对照也不出,那应该就有问题了,可以优化一下pcr条件,做梯度pcr看改变温度了会不会出现结果吧,你做的是流调吧,也有可能本来就是样品的感染率低吧

主要是没有现成的基因,没有办法做阳性对照,引物确实没有问题,有文献已经做出来的,我做的是同源克隆,退火温度用文献里的温度一直做不出来,不知道怎么回事?
5楼2013-04-10 18:34:52
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haifaaini

银虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by yujitianqing at 2013-04-10 13:26:39
一般是退火温度、引物或者是模板出问题。
退火温度出问题,可能使引物无法结合或错误结合;引物如果没设计好,可能出现二聚体;模板可能出现断裂……
你逐一检查下……

好的,我试一下,谢谢了。
6楼2013-04-10 18:35:47
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haifaaini

银虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by shui_hanliu at 2013-04-10 13:00:55
增加一个阳性对照,可以是你们同学能够做得出结果的实验,按你的体系一一加入,用它的退火温度,如果能出来,说明体系没问题,你应该考虑模板是否正确,退货温度是否合适,还有引物没设计错吧

我的基因没有现成的,没法做阳性对照,引物是别人设计好的,已经做出来的引物,应该不会错的,我就是觉得是不是退火温度的事?但是别人用那个引物和退火温度已经做出来了,我怕是体系的问题,不知道该怎么办?
7楼2013-04-10 18:37:51
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710002191

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
haifaaini: 金币+15, ★★★很有帮助 2013-04-11 18:07:24
引用回帖:
5楼: Originally posted by haifaaini at 2013-04-10 18:34:52
主要是没有现成的基因,没有办法做阳性对照,引物确实没有问题,有文献已经做出来的,我做的是同源克隆,退火温度用文献里的温度一直做不出来,不知道怎么回事?...

要是中文文献的话,我只想说文献里都是骗人的,你不可能做出那样的结果,要是英文文献的话应该在看看吧,也是有可能的

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may
8楼2013-04-11 08:09:18
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haifaaini

银虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by 710002191 at 2013-04-11 08:09:18
要是中文文献的话,我只想说文献里都是骗人的,你不可能做出那样的结果,要是英文文献的话应该在看看吧,也是有可能的...

谢谢你,那我再看看。
9楼2013-04-11 18:07:46
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情毒之殇

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
会不会是酶的问题?我现在大三,但是跟老师一起做PCR一年了,通常实验一直没结果,老师会让换一支酶尝试一下
我们的心是荒野还是沃土?!
10楼2013-04-12 15:27:27
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