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haifaaini

银虫 (初入文坛)

[求助] PCR技术

最近一直做pcr，一直没有结果，我该怎么设计实验，来判定是体系的问题，还是程序的问题呢？ 谢谢了
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1楼 2013-04-10 12:34:31
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710002191

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
haifaaini(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-11 08:12:05
新虫小说两句，应该有阳性对照吧，要是阳性对照也不出，那应该就有问题了，可以优化一下pcr条件，做梯度pcr看改变温度了会不会出现结果吧，你做的是流调吧，也有可能本来就是样品的感染率低吧
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may
2楼2013-04-10 12:51:11
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shui_hanliu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
haifaaini(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天 2013-04-11 08:12:23
增加一个阳性对照，可以是你们同学能够做得出结果的实验，按你的体系一一加入，用它的退火温度，如果能出来，说明体系没问题，你应该考虑模板是否正确，退货温度是否合适，还有引物没设计错吧
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haifaaini
3楼2013-04-10 13:00:55
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yujitianqing

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
haifaaini(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-11 08:12:34
一般是退火温度、引物或者是模板出问题。
退火温度出问题，可能使引物无法结合或错误结合；引物如果没设计好，可能出现二聚体；模板可能出现断裂……
你逐一检查下……
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haifaaini
4楼2013-04-10 13:26:39
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haifaaini

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 710002191 at 2013-04-10 12:51:11
新虫小说两句，应该有阳性对照吧，要是阳性对照也不出，那应该就有问题了，可以优化一下pcr条件，做梯度pcr看改变温度了会不会出现结果吧，你做的是流调吧，也有可能本来就是样品的感染率低吧

主要是没有现成的基因，没有办法做阳性对照，引物确实没有问题，有文献已经做出来的，我做的是同源克隆，退火温度用文献里的温度一直做不出来，不知道怎么回事？
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5楼2013-04-10 18:34:52
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haifaaini

银虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by yujitianqing at 2013-04-10 13:26:39
一般是退火温度、引物或者是模板出问题。
退火温度出问题，可能使引物无法结合或错误结合；引物如果没设计好，可能出现二聚体；模板可能出现断裂……
你逐一检查下……

好的，我试一下，谢谢了。
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6楼2013-04-10 18:35:47
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haifaaini

银虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by shui_hanliu at 2013-04-10 13:00:55
增加一个阳性对照，可以是你们同学能够做得出结果的实验，按你的体系一一加入，用它的退火温度，如果能出来，说明体系没问题，你应该考虑模板是否正确，退货温度是否合适，还有引物没设计错吧

我的基因没有现成的，没法做阳性对照，引物是别人设计好的，已经做出来的引物，应该不会错的，我就是觉得是不是退火温度的事？但是别人用那个引物和退火温度已经做出来了，我怕是体系的问题，不知道该怎么办？
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7楼2013-04-10 18:37:51
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710002191

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
haifaaini: 金币+15, ★★★很有帮助 2013-04-11 18:07:24
引用回帖:
5楼: Originally posted by haifaaini at 2013-04-10 18:34:52
主要是没有现成的基因，没有办法做阳性对照，引物确实没有问题，有文献已经做出来的，我做的是同源克隆，退火温度用文献里的温度一直做不出来，不知道怎么回事？...

要是中文文献的话，我只想说文献里都是骗人的，你不可能做出那样的结果，要是英文文献的话应该在看看吧，也是有可能的
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haifaaini
may
8楼2013-04-11 08:09:18
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haifaaini

银虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by 710002191 at 2013-04-11 08:09:18
要是中文文献的话，我只想说文献里都是骗人的，你不可能做出那样的结果，要是英文文献的话应该在看看吧，也是有可能的...

谢谢你，那我再看看。
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9楼2013-04-11 18:07:46
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情毒之殇

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
会不会是酶的问题？我现在大三，但是跟老师一起做PCR一年了，通常实验一直没结果，老师会让换一支酶尝试一下
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我们的心是荒野还是沃土？！
10楼2013-04-12 15:27:27
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