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若乔西木

银虫 (初入文坛)

[求助] MTT求助

我刚上手做MTT试验，养的细胞是HepG2.有几个问题，希望各位高手能帮我解答。
1.  细胞计数  用计数板计数的时候，是先计数，然后稀释到想要的浓度，还是先稀释到差不多的样子再去计数啊？
2. 96孔板接种的密度   一般大家都说5000/孔，我按这个浓度种板后24小时仍发现96孔板里每个孔里的细胞长的并不是很多（20%），是不是这个密度还是太低了。
3.  我种板后发现我的细胞长的并不均匀，集中在每个孔的中间，外周几乎没有。这是细胞的生长习性还是我种板时没有种好啊?我种板后会学着别人把板左右上下往返移动3下，这样到底好不好啊？怎样才能使细胞均匀分散在孔里面呢？
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1楼 2013-04-10 08:47:31
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

weskerZXC

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-04-10 16:42:36
若乔西木: 金币+1, ★有帮助, 多谢 2013-04-11 08:34:15
1.如果是用100π平板，长满了的HepG2应该是10的七次方左右，你可以根据这个数量自己考虑稀释的倍数；
2.我们也是做有关肿瘤细胞的，一般我们铺96孔板细胞数量在10000个/孔，而且在铺板过程中，要将细胞迅速打到侧壁上，这样铺的细胞比较均匀，铺完细胞不能晃动96孔板；
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5楼2013-04-10 16:11:59
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 若乔西木 at 2013-04-10 16:14:31
谢谢这位好心的朋友。我打算种板后总共培养3天，那就是说估计一个种板密度，使其3天后会长满到90%左右是吗？...

是这个意思，还有种多大的密度，要看你的细胞生长速度，你比如我用的是Hela细胞做MTT，我要连续测94小时，所以我选择了种2000个/well
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8楼2013-04-10 17:25:01
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young123

金虫 (小有名气)
你好，我也用HepG2做过MTT的实验，首先，计数我都是稀释10倍再计；然后，种板的密度我一般是6000个/孔，种200μL的话就是细胞密度3*10^4个/ml；最后，种细胞的时候把枪头放在96孔的侧壁，然后慢慢贴壁打下去，这样子会种的比较均匀。
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10楼2013-04-11 09:14:59
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普通回帖

zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-04-10 15:34:34
若乔西木: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-04-10 16:03:46
1、首先肯定得先计数在稀释到相应的浓度。
2、对于接种密度这个问题，我觉得可以根据自己所需来灵活接种，这个没有绝对的定量。
3、对于细胞全部跑到中间去了这个问题。我觉得这是个技术活，楼主种好后一定要轻拿轻放；或者种好后放在超净台静置10分钟左右再拿出来放在培养箱里面；或者左敲敲右敲敲上敲敲下敲敲再放进培养箱里面。
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keepon
2楼2013-04-10 14:19:53
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
若乔西木: 金币+1, ★有帮助, 多谢 2013-04-10 16:04:06
小丹木木: 金币+2, 斑斑辛苦 2013-04-10 16:42:25
1.如果细胞密度过大，可以稀释10倍计数，如果不大的话，就直接计数吧

2. 至于接种密度，要看你做什么用途，细胞的继续培养时间，选择合适的细胞种板个数

3. 细胞种的均匀，看2楼分析
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2013-04-10 15:37:13
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若乔西木

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-04-10 14:19:53
1、首先肯定得先计数在稀释到相应的浓度。
2、对于接种密度这个问题，我觉得可以根据自己所需来灵活接种，这个没有绝对的定量。
3、对于细胞全部跑到中间去了这个问题。我觉得这是个技术活，楼主种好后一定要轻拿 ...

谢谢楼上朋友。对于第2个问题，我有问过我同学，他说他做MTT实验接种后细胞贴壁即给药，那时他的细胞已经长到70-80%，然后我想想我的细胞密度和生长速度，无论怎么样也达不到那个密度。是种板的时候就把细胞密度种大一点吗？
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4楼2013-04-10 16:03:19
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若乔西木

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-10 15:37:13
1.如果细胞密度过大，可以稀释10倍计数，如果不大的话，就直接计数吧

2. 至于接种密度，要看你做什么用途，细胞的继续培养时间，选择合适的细胞种板个数

3. 细胞种的均匀，看2楼分析

谢谢这位好心的朋友。我打算种板后总共培养3天，那就是说估计一个种板密度，使其3天后会长满到90%左右是吗？
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6楼2013-04-10 16:14:31
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2013-04-10 16:42:52
引用回帖:
4楼: Originally posted by 若乔西木 at 2013-04-10 16:03:19
谢谢楼上朋友。对于第2个问题，我有问过我同学，他说他做MTT实验接种后细胞贴壁即给药，那时他的细胞已经长到70-80%，然后我想想我的细胞密度和生长速度，无论怎么样也达不到那个密度。是种板的时候就把细胞密度种 ...

恩 是的。。。每种细胞性质不一样。。所以如果需要细胞长到70%-80%的话你可以多种点。。。还有你是测什么呢？如果你是70%-80%的时候给药但是需要48小时再测的话。。那样48小时会不会长过呢？所以这是实验不具有普遍性而是个体差异性。。。
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keepon
7楼2013-04-10 16:41:03
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若乔西木

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-04-10 16:41:03
恩 是的。。。每种细胞性质不一样。。所以如果需要细胞长到70%-80%的话你可以多种点。。。还有你是测什么呢？如果你是70%-80%的时候给药但是需要48小时再测的话。。那样48小时会不会长过呢？所以这是实验不具有普遍 ...

我是种板后用药物干预，摸索药物的无毒浓度。因为我种板后，发现细胞集中在中间长，四周没有细胞，看上去感觉细胞长得不快，所以我在想种板的时候可以种密一点。但是在培养瓶里面细胞长得快些，不知道为什么
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9楼2013-04-11 08:37:02
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