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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 紧急求助：酵母中GFP问题
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绿草如茵

木虫 (小有名气)

[求助] 紧急求助：酵母中GFP问题

大家好，本人想做一个蛋白在酵母中的定位情况，GFP在N端与目的基因融合，在酵母中表达后，利用荧光显微镜观察（融合基因证实转进去了），就是看不见应该，请问是怎么回事？而对照（仅GFP连接表达载体的）有荧光，请大家帮忙分析师怎么回事？不胜感激！
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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索！
1楼 2013-04-08 22:09:18
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绿草如茵

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2013-04-09 00:13:14
1 楼主检查一下构建载体时有没犯低级错误，如终止子该不该有的问题
2 我没搞过酵母荧光，但从做植物经验看，GFP在N端还是C端有时候影响结果，楼主试试构建一个C端的3
3 有些荧光标记蛋白在酵母中用激光共聚焦也看 ...

谢谢你的回答！1.我在N端融合GFP是 没有加终止密码子的。
                     2。现在的问题是对照eGFP+载体有荧光，融合了我目的基因的都没有荧光！
                      3。我的对照也是在同一个酵母宿主的，对照荧光很亮，我们的ZEISS是710，看对照或者别的表达体系里的荧光就很好，所以仪器应该没有问题！
     所以郁闷。。。。。。。不知道是怎么回事？同样在N端，在洋葱表皮里面就表达得很好！。。。。。。郁闷 啊！
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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索！
3楼2013-04-09 08:47:51
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+3, 谢谢分享经验 2013-04-09 07:48:50
1 楼主检查一下构建载体时有没犯低级错误，如终止子该不该有的问题
2 我没搞过酵母荧光，但从做植物经验看，GFP在N端还是C端有时候影响结果，楼主试试构建一个C端的3
3 有些荧光标记蛋白在酵母中用激光共聚焦也看不出来，上次Zeiss的一个工程师来安装新机器，他介绍老式的LSM510看不了一些酵母的荧光结果，而他们的新LSM780就可以，楼主可以考虑换用更强大的机器。
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
2楼2013-04-09 00:13:14
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 绿草如茵 at 2013-04-09 08:47:51
谢谢你的回答！1.我在N端融合GFP是 没有加终止密码子的。
                     2。现在的问题是对照eGFP+载体有荧光，融合了我目的基因的都没有荧光！
                      3。我的对照也是在同一个酵母宿主的 ...

洋葱和酵母成像效果差很多，没有多少可比性，照你的描述有可能就是你的目的集团有影响，有没试过连RFPYFP之类的
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
4楼2013-04-09 18:22:27
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