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绿草如茵

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[求助] 紧急求助：酵母中GFP问题

大家好，本人想做一个蛋白在酵母中的定位情况，GFP在N端与目的基因融合，在酵母中表达后，利用荧光显微镜观察（融合基因证实转进去了），就是看不见应该，请问是怎么回事？而对照（仅GFP连接表达载体的）有荧光，请大家帮忙分析师怎么回事？不胜感激！

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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索！

1楼 2013-04-08 22:09:18

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starseacow

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
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wizardfan: 金币+3, 谢谢分享经验 2013-04-09 07:48:50

1 楼主检查一下构建载体时有没犯低级错误，如终止子该不该有的问题
2 我没搞过酵母荧光，但从做植物经验看，GFP在N端还是C端有时候影响结果，楼主试试构建一个C端的3
3 有些荧光标记蛋白在酵母中用激光共聚焦也看不出来，上次Zeiss的一个工程师来安装新机器，他介绍老式的LSM510看不了一些酵母的荧光结果，而他们的新LSM780就可以，楼主可以考虑换用更强大的机器。

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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息

2楼2013-04-09 00:13:14

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引用回帖:

2楼: Originally posted by starseacow at 2013-04-09 00:13:14
1 楼主检查一下构建载体时有没犯低级错误，如终止子该不该有的问题
2 我没搞过酵母荧光，但从做植物经验看，GFP在N端还是C端有时候影响结果，楼主试试构建一个C端的3
3 有些荧光标记蛋白在酵母中用激光共聚焦也看 ...

谢谢你的回答！1.我在N端融合GFP是没有加终止密码子的。
                  2。现在的问题是对照eGFP+载体有荧光，融合了我目的基因的都没有荧光！
                  3。我的对照也是在同一个酵母宿主的，对照荧光很亮，我们的ZEISS是710，看对照或者别的表达体系里的荧光就很好，所以仪器应该没有问题！
   所以郁闷。。。。。。。不知道是怎么回事？同样在N端，在洋葱表皮里面就表达得很好！。。。。。。郁闷啊！

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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索！

3楼2013-04-09 08:47:51

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