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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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heji

木虫 (初入文坛)

[求助] 请教以基因组DNA为模板进行PCR的问题

我前段时间提取了单只果蝇的基因组DNA(基因组DNA的质量已经电泳验证)。现在想PCR扩出其中某一基因的一段序列,大约600多bp,引物应该没有问题(设计引物时是根据基因组DNA设计的,并非根据mRNA)。退火温度从44度,一直到62度我都做了梯度PCR,但是一直都未出现条带。想请问高手们,是否在以基因组DNA为模板前要预先做某些处理呢?谢谢!

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IDname

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钢虫


heji(金币+1,VIP+0):谢谢
什么叫做“引物应该没有问题”?
如果不好P就换引物。可以上网搜索一下别人克隆这个基因的时候都用过哪些引物?直接照抄一个。网上还有很多的引物设计的数据库可以参考。
4楼2007-09-11 18:33:33
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wu2008yao

木虫 (小有名气)


heji(金币+1,VIP+0):谢谢
建议可以降低温度试试!
引物有多长?pcr体系如何?
还有你的程序也是有影响的?
生命是一团欲望,欲望不满足便痛苦,满足便无聊。人生就在痛苦和无聊之间摇摆!
2楼2007-09-11 09:32:48
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heji

木虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by wu2008yao at 2007-9-11 09:32 AM:
建议可以降低温度试试!
引物有多长?pcr体系如何?
还有你的程序也是有影响的?

温度我做过两次梯度PCR,退火温度分别从44度至51度,51度至62度。
上游引物为18bp
下游引物为20bp
PCR体系为:
Forward Primer                            1μl
Reverse Primer                            1μl
dNTPs(10mM)                          0.5μl
10×buffer(Mg2+ free)               2.5μl
Mgcl2                                      1.5μl
Taq                                         0.5μl
Template(genomic DNA)               4μl
ddH2O                                      14μl
Total           25μl
3楼2007-09-11 09:46:53
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heji

木虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by IDname at 2007-9-11 06:33 PM:
什么叫做“引物应该没有问题”?
如果不好P就换引物。可以上网搜索一下别人克隆这个基因的时候都用过哪些引物?直接照抄一个。网上还有很多的引物设计的数据库可以参考。

我之所以说引物没有问题,是因为我从cDNA里能扩增出相应的片段,而从基因组DNA里则不行。
另,该基因并无人登录全长至GenBank,目前仅有一个partial CDS,我现在是想在基因组DNA里验证一次,看能否在基因组DNA里扩增出该片段。
还请指教!谢谢!

[ Last edited by heji on 2007-9-11 at 19:15 ]
5楼2007-09-11 19:14:28
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