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heji

木虫 (初入文坛)

[求助] 请教以基因组DNA为模板进行PCR的问题

我前段时间提取了单只果蝇的基因组DNA（基因组DNA的质量已经电泳验证）。现在想PCR扩出其中某一基因的一段序列，大约600多bp，引物应该没有问题（设计引物时是根据基因组DNA设计的，并非根据mRNA）。退火温度从44度，一直到62度我都做了梯度PCR，但是一直都未出现条带。想请问高手们，是否在以基因组DNA为模板前要预先做某些处理呢？谢谢！
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1楼 2007-09-11 08:37:55
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wu2008yao

木虫 (小有名气)
★
heji(金币+1,VIP+0):谢谢
建议可以降低温度试试！
引物有多长？pcr体系如何？
还有你的程序也是有影响的？
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生命是一团欲望，欲望不满足便痛苦，满足便无聊。人生就在痛苦和无聊之间摇摆！
2楼2007-09-11 09:32:48
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heji

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by wu2008yao at 2007-9-11 09:32 AM:
建议可以降低温度试试！
引物有多长？pcr体系如何？
还有你的程序也是有影响的？

温度我做过两次梯度PCR，退火温度分别从44度至51度，51度至62度。
上游引物为18bp
下游引物为20bp
PCR体系为：
Forward Primer                            1μl
Reverse Primer                            1μl
dNTPs(10mM)                          0.5μl
10×buffer(Mg2+ free)               2.5μl
Mgcl2                                      1.5μl
Taq                                         0.5μl
Template(genomic DNA)               4μl
ddH2O                                      14μl
Total           25μl
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3楼2007-09-11 09:46:53
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IDname

捐助贵宾 (正式写手)

钢虫
★
heji(金币+1,VIP+0):谢谢
什么叫做“引物应该没有问题”？
如果不好P就换引物。可以上网搜索一下别人克隆这个基因的时候都用过哪些引物？直接照抄一个。网上还有很多的引物设计的数据库可以参考。
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4楼2007-09-11 18:33:33
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heji

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by IDname at 2007-9-11 06:33 PM:
什么叫做“引物应该没有问题”？
如果不好P就换引物。可以上网搜索一下别人克隆这个基因的时候都用过哪些引物？直接照抄一个。网上还有很多的引物设计的数据库可以参考。

我之所以说引物没有问题，是因为我从cDNA里能扩增出相应的片段，而从基因组DNA里则不行。
另，该基因并无人登录全长至GenBank，目前仅有一个partial CDS，我现在是想在基因组DNA里验证一次，看能否在基因组DNA里扩增出该片段。
还请指教！谢谢！

[ Last edited by heji on 2007-9-11 at 19:15 ]
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5楼2007-09-11 19:14:28
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heji

木虫 (初入文坛)
还请大家帮忙！
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6楼2007-09-13 08:32:44
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IDname

捐助贵宾 (正式写手)

钢虫
莫非有传说中的外显子还是内涵子？具体那个词记不清了，反正就是不表达的那部分序列。
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7楼2007-09-14 19:46:46
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zhangwei-fhm1

★
heji(金币+1,VIP+0):谢谢！
同一引物，不同DNA会出现，有的DNA 扩不出来。用多个引物试一下，并检查DNA纯度。
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8楼2007-09-14 21:09:50
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littlemud

铁杆木虫 (小有名气)
建议提纯1. template DNA 有两个目的：确定DNA 的量，去掉inhibitor
            2. 延长你的退火时间。因为可能是DNA 双链没能完全打开，造成扩增不理想。。。。
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9楼2007-09-22 13:07:48
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