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浪漫的马

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by porphybaby at 2013-03-28 00:30:15
是条带不清晰还是条带非常浅？背景高？

如果是条带很明亮但是不清晰，那就是你操作的问题。你可能需要提高WB的操作技术 特别是电泳和转膜 胶要做好 上样的时候也要注意 量要适中 还有转膜的时候 注意一下转膜的条 ...

是条带不清晰，难道是个人技术的问题，因为师兄师姐他们接大分子的好像都不太容易。所以说我并没有怀疑我的技术，另一个我是把细胞收集到离心管中加裂解液的。至于基因本身很少到时有可能。想请问一下细胞的生长状态影响基因的表达吗？像我做胰岛素受体选用哪种细胞好点呢？谢谢
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11楼2013-03-28 16:45:47
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浪漫的马

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by dengqiong301 at 2013-03-28 01:40:00
首先还是从技术上去找问题，可以直接把提取的蛋白跑个胶，用考马斯亮蓝染下看看条带如何。
也有可能目的蛋白比较容易降解，所以最好加一定量的蛋白酶抑制剂。
acting其实是actin，一种常见内参，内参表达量而且稳 ...

蛋白酶抑制剂是在裂解的时候加的吗？我我们好像之前没有加过，专门有卖的吗？
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12楼2013-03-28 16:49:58
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dengqiong301

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 热心的虫虫 2013-03-29 16:09:50
引用回帖:
12楼: Originally posted by 浪漫的马 at 2013-03-28 16:49:58
蛋白酶抑制剂是在裂解的时候加的吗？我我们好像之前没有加过，专门有卖的吗？...

一般看蛋白的量吧，蛋白量多的话，损耗一点也就算了，如果是微量表达的话，适量加一些吧。有专门卖的，也不是太贵，问问试剂公司吧，我用的是蛋白提取试剂盒自带的。其实WB的原理都还是蛮简单的，关键是细节问题，多请教下实验室里做过的人吧，有些东西也和环境有关，和实验室用的器材有关，诸多因素吧，祝顺利。
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13楼2013-03-29 09:32:55
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浪漫的马

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by dengqiong301 at 2013-03-28 01:40:00
首先还是从技术上去找问题，可以直接把提取的蛋白跑个胶，用考马斯亮蓝染下看看条带如何。
也有可能目的蛋白比较容易降解，所以最好加一定量的蛋白酶抑制剂。
acting其实是actin，一种常见内参，内参表达量而且稳 ...

蛋白酶抑制剂是什么？难道是没加，造成目的蛋白降解？我们用的细胞裂解液一般为蛋白裂解液+pmsf(100:1），蛋白酶抑制剂我们之前还没加过。请问你们的蛋白酶抑制剂是什么？是有专门买的还是自己配置？另一个想请教相关文献怎么查询？求指导？谢谢！
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14楼2013-03-29 19:26:39
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浪漫的马

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by dengqiong301 at 2013-03-28 01:40:00
首先还是从技术上去找问题，可以直接把提取的蛋白跑个胶，用考马斯亮蓝染下看看条带如何。
也有可能目的蛋白比较容易降解，所以最好加一定量的蛋白酶抑制剂。
acting其实是actin，一种常见内参，内参表达量而且稳 ...

蛋白酶抑制剂是PMSF吗？
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15楼2013-03-29 19:42:13
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dengqiong301

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by 浪漫的马 at 2013-03-29 19:42:13
蛋白酶抑制剂是PMSF吗？...

PMSF may be one kind of protease inhibitors. I often use a protease inbibitor cocktail, it is a mixture of several kinds of inhibitors. I have no idea about the protein you work with now, so you may have to check some literatures about this protein: extration, WB protocol and so on. you can check it online, google or NCBI, etc. you shoul be taught to do this by your supervisor, not me.
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16楼2013-03-30 00:30:40
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dengqiong301

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by 浪漫的马 at 2013-03-29 19:26:39
蛋白酶抑制剂是什么？难道是没加，造成目的蛋白降解？我们用的细胞裂解液一般为蛋白裂解液+pmsf(100:1），蛋白酶抑制剂我们之前还没加过。请问你们的蛋白酶抑制剂是什么？是有专门买的还是自己配置？另一个想请教相 ...

OK, protease inhbitor may be one of the causes, not the main one. You still have to check a lot of key points. we bought it from a company, but I forgot its name. I can give you my protocl if you are interested in, just send me a Email: dengqiong11@mails.jlu.edu.cn
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17楼2013-03-30 00:34:34
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porphybaby

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

要加蛋白酶抑制剂的

推荐 Roche Protease Inhibitor Cocktail 好像叫做 Complete, EDTA-free 这样的。。。

就是有点贵  一盒要三千多 里头有很多粒像药片一样的一片片的混合蛋白酶抑制剂 只要把它一片溶在裂解液中 基本上 就不会担心降解问题了
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18楼2013-03-30 00:40:21
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