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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » WB做不出来
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浪漫的马

新虫 (初入文坛)

[求助] WB做不出来

小虫做WB已经快半年了，但是一直没做出来，蛋白是从MCF-7和HepG-2提取的，我接的一抗是胰岛素受体，出来的条带始终是模模糊糊的，请高手指点。
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1楼 2013-03-25 15:35:52
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

dengqiong301

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
浪漫的马: 金币+2, ★有帮助 2013-03-28 16:50:19
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-03-29 16:09:33
浪漫的马: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-04-17 11:45:34
首先还是从技术上去找问题，可以直接把提取的蛋白跑个胶，用考马斯亮蓝染下看看条带如何。
也有可能目的蛋白比较容易降解，所以最好加一定量的蛋白酶抑制剂。
acting其实是actin，一种常见内参，内参表达量而且稳定，所以会比较好检测。内参必须是比较明显清晰。
我们用的都是比较好的抗体，santa cruze或者millipore、abCam等
另外对于你研究的蛋白不懂，会不会有其他亚型，或者修饰，造成条带模糊，可以查询相关文献，祝好运
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10楼2013-03-28 01:40:00
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普通回帖

peakg7

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
浪漫的马: 金币+2, ★有帮助 2013-03-25 18:13:28
有没有染其他的，像内参抗体，确定是不是技术问题。不是，那就是这个一抗有问题了，换一个试试了
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2楼2013-03-25 16:51:29
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浪漫的马

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by peakg7 at 2013-03-25 16:51:29
有没有染其他的，像内参抗体，确定是不是技术问题。不是，那就是这个一抗有问题了，换一个试试了

可是有条带，就是不清楚，难道大分子的就不太还接？我接下来再染个内参试试。
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3楼2013-03-25 18:05:39
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浪漫的马

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 浪漫的马 at 2013-03-25 18:05:39
可是有条带，就是不清楚，难道大分子的就不太还接？我接下来再染个内参试试。...

今天接了个内参抗体，有条带，非常的明显，能确定是一抗的问题吗，各位虫友，你们接大分子的一抗好接吗，都用的那个公司的一抗呀？
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4楼2013-03-26 17:02:51
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ouchappy

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
浪漫的马: 金币+2, ★有帮助 2013-03-27 15:45:54
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2013-03-29 16:09:06
本帖内容被屏蔽
5楼2013-03-27 10:16:25
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浪漫的马

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ouchappy at 2013-03-27 10:16:25
可能是一抗的问题。
你可以在这个网站上找一下，http://www.labome.cn/。
针对每一种抗体，他们还手动查找了一些文献，

谢谢，我看一下
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6楼2013-03-27 15:45:32
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dearzhanglei

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 16:44:58
同时加个acting做对照，如果acting也是模糊的，那就是技术问题了！
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7楼2013-03-27 18:32:27
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浪漫的马

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by dearzhanglei at 2013-03-27 18:32:27
同时加个acting做对照，如果acting也是模糊的，那就是技术问题了！

acting是什么呢？怎么做呢
？
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8楼2013-03-27 20:28:19
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porphybaby

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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浪漫的马: 金币+3 2013-03-28 16:46:00
小丹木木: 金币+4, 鼓励积极交流经验 2013-03-29 16:09:24
是条带不清晰还是条带非常浅？背景高？

如果是条带很明亮但是不清晰，那就是你操作的问题。你可能需要提高WB的操作技术 特别是电泳和转膜 胶要做好 上样的时候也要注意 量要适中 还有转膜的时候 注意一下转膜的条件 有的时候是 你的内参蛋白很容易转上 但是你的目的蛋白就转不完全 那样就会导致条带很浅 背景深 而如果你的转膜三明治没有做好 有可能会转得花掉 条带扭曲 甚至上不了膜

如果是 你的条带形状啊之类的 都不错 但是就特别浅 那有很多种原因的

一方面 会不会你的基因本身量很少 那样当然条带暗
另一方面 你是怎么去裂解细胞的 是不是裂解液加太多了 你是消化之后收集细胞到离心管中 再加裂解液的  还是 直接往培养皿或培养瓶中加裂解液覆盖整个底部的？ 如果是后者 蛋白浓度会 大大降低 内参可以出来 但 目的基因未必能出来

还有就是 你一抗会不会结合的不好 二抗又是否正常
你要先排查一下其他的原因 再来 怀疑到一抗 否则 会很浪费钱
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9楼2013-03-28 00:30:15
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