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毛状根DNA的提取
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求助啊！！！！！！！！ 现在在做东南景天的毛状根诱导，按照CTAB法的试剂盒提取，死活提取不出来毛状根的DNA啊！！！！ 文献上报道说SDS和CTAB法都可以提出出来，为毛我的就提取不出来呢？？？ 虫友们帮我啊。。。。哭。。。。。  |
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starseacow
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2楼2013-03-20 19:24:46
泠安然
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3楼2013-03-21 16:54:03
送鲜花一朵 |
是这样的： 1.取毛状根0.5g（因为我的毛状根长的不好，所以原料很少，各位有什么好办法令毛状根长势好一些么？），液氮研磨至粉末。 2.转移细粉到一个1.5ml离心管，不解冻，加600μl 65℃预热的裂解液PL (加入β-巯基乙醇至2%)，剧烈涡旋振荡混匀，用大口径枪头轻柔吹打帮助裂解，加入6μl RNA酶（20mg/ml）。 3.65℃水浴30分钟，在水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。 4.用等体积酚/氯仿（1：1）抽提一遍。 5.加入700μl氯仿/异戊醇（体积比24：1混合），颠倒充分混匀几分钟，13,000rpm 离心5分钟。 6.小心吸取上清到新的1.5ml离心管。如上清比较浑浊，则需要重复步骤4一遍，直到得到透亮上清。 7.加入1.5倍体积结合液PQ （已加入无水乙醇）后立刻涡旋，充分混匀。 8.将上一步所得混合物（包括可能出现的沉淀）加入吸附柱AC中，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。 8. 加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。 9. 加入700μl漂洗液WB（已加入无水乙醇），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。 10. 加入500μl漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。 11. 将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，除去漂洗液。 12. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65℃水浴中预热），室温放置3-5分钟，12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。 就这样，用的试剂公司的试剂盒，买过两次，康为的和艾德莱公司，植物CTAB法提取试剂盒，提过N次还是提不出来。。。 要哭了。。。 |
4楼2013-03-21 21:34:54
5楼2013-03-21 21:36:41
starseacow
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【答案】应助回帖
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Bella0224: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-03-22 15:19:07
Bella0224: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-03-22 15:19:07
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1 关于发根怎样加快生长，可以对培养条件进行优化，入手方向包括培养基，温度，光照，转速，培养瓶装液量等等 2 楼主贴的方法应该是直接参照试剂盒的吧，我做试剂都是自己配的，一般不用试剂盒（有时候试剂盒吹得很厉害，但很可能只是对特定某些植物材料效果比较好，使用试剂盒不太好自己调整摸索）。你的问题一方面我感觉可能是植物材料裂解不完全，试试延长65度处理时间，酚氯仿抽提步骤也不要重复太多次。此外，接下来先不用吸附柱，可以换成传统CTAB法的处理步骤试试，看能否获得DNA。 |
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6楼2013-03-22 05:39:58
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