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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 综合其他 » 毛状根DNA的提取
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Bella0224

金虫 (小有名气)

[求助] 毛状根DNA的提取

求助啊！！！！！！！！

现在在做东南景天的毛状根诱导，按照CTAB法的试剂盒提取，死活提取不出来毛状根的DNA啊！！！！

文献上报道说SDS和CTAB法都可以提出出来，为毛我的就提取不出来呢？？？

虫友们帮我啊。。。。哭。。。。。
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1楼 2013-03-20 11:16:51
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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xy656691: 金币+2, 感谢应助 2013-03-21 19:44:55
Bella0224: 金币+2, ★有帮助 2013-03-21 21:26:15
CTAB法可以提取发根DNA，楼主需要详细说明你的实验条件与实验步骤，单凭这么几句话，谁也帮不了你
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Bella0224
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2楼2013-03-20 19:24:46
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泠安然

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xy656691: 金币+5, 感谢应助 2013-03-21 19:45:08
Bella0224: 金币+3, ★有帮助 2013-03-21 21:25:18
我们提取毛状根的时候就是用的CTAB，研磨时候用的石英砂和PVP，其中还用到了苯酚，氯仿等溶剂进行纯化，你应该把步骤贴出来，这样才能知道你是哪个步骤出的问题
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Bella0224
3楼2013-03-21 16:54:03
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Bella0224

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 泠安然 at 2013-03-21 16:54:03
我们提取毛状根的时候就是用的CTAB，研磨时候用的石英砂和PVP，其中还用到了苯酚，氯仿等溶剂进行纯化，你应该把步骤贴出来，这样才能知道你是哪个步骤出的问题

是这样的：

1.取毛状根0.5g（因为我的毛状根长的不好，所以原料很少，各位有什么好办法令毛状根长势好一些么？），液氮研磨至粉末。
2.转移细粉到一个1.5ml离心管，不解冻，加600μl 65℃预热的裂解液PL (加入β-巯基乙醇至2%)，剧烈涡旋振荡混匀，用大口径枪头轻柔吹打帮助裂解，加入6μl RNA酶（20mg/ml）。
3.65℃水浴30分钟，在水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。
4.用等体积酚/氯仿（1：1）抽提一遍。
5.加入700μl氯仿/异戊醇（体积比24：1混合），颠倒充分混匀几分钟，13,000rpm 离心5分钟。
6.小心吸取上清到新的1.5ml离心管。如上清比较浑浊，则需要重复步骤4一遍，直到得到透亮上清。
7.加入1.5倍体积结合液PQ （已加入无水乙醇）后立刻涡旋，充分混匀。
8.将上一步所得混合物（包括可能出现的沉淀）加入吸附柱AC中，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。
8.        加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。
9.        加入700μl漂洗液WB（已加入无水乙醇），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。
10.        加入500μl漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。
11.        将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，除去漂洗液。
12.        取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65℃水浴中预热），室温放置3-5分钟，12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。

就这样，用的试剂公司的试剂盒，买过两次，康为的和艾德莱公司，植物CTAB法提取试剂盒，提过N次还是提不出来。。。

要哭了。。。
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4楼2013-03-21 21:34:54
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Bella0224

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2013-03-20 19:24:46
CTAB法可以提取发根DNA，楼主需要详细说明你的实验条件与实验步骤，单凭这么几句话，谁也帮不了你

我在楼下回复了，有详细的实验步骤，麻烦各位虫友了。。。。

PS：我的毛状根材料很少，提取时取的量比较少，跑电泳图在紫外下照只有Marker，DNA一点都没有
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5楼2013-03-21 21:36:41
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
Bella0224: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-03-22 15:19:07
1 关于发根怎样加快生长，可以对培养条件进行优化，入手方向包括培养基，温度，光照，转速，培养瓶装液量等等
2 楼主贴的方法应该是直接参照试剂盒的吧，我做试剂都是自己配的，一般不用试剂盒（有时候试剂盒吹得很厉害，但很可能只是对特定某些植物材料效果比较好，使用试剂盒不太好自己调整摸索）。你的问题一方面我感觉可能是植物材料裂解不完全，试试延长65度处理时间，酚氯仿抽提步骤也不要重复太多次。此外，接下来先不用吸附柱，可以换成传统CTAB法的处理步骤试试，看能否获得DNA。
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Bella0224
植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
6楼2013-03-22 05:39:58
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紫眸玉儿

木虫 (小有名气)
从你的表述中，可以看出毛状根DNA量特别少，建议扩增内源基因，单纯电泳跑DNA由于量少，没有结果很正常！
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7楼2013-03-22 10:35:44
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Bella0224

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 紫眸玉儿 at 2013-03-22 10:35:44
从你的表述中，可以看出毛状根DNA量特别少，建议扩增内源基因，单纯电泳跑DNA由于量少，没有结果很正常！

我是否需设计引物进行PCR就可以了？扩增毛状根DNA，只需指的植物基因组DNA的开头和结尾，然后加上引物PCR对么？
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8楼2013-03-22 15:18:52
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Bella0224

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by starseacow at 2013-03-22 05:39:58
1 关于发根怎样加快生长，可以对培养条件进行优化，入手方向包括培养基，温度，光照，转速，培养瓶装液量等等
2 楼主贴的方法应该是直接参照试剂盒的吧，我做试剂都是自己配的，一般不用试剂盒（有时候试剂盒吹得很 ...

不用吸附柱的CTAB法。。。好的，我去试一试~
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9楼2013-03-22 15:19:32
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