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炭笔橡皮

新虫 (初入文坛)

[求助] 单细胞PCR

我最近要做单细胞PCR，是用显微操作获取细胞的，吸到倒是没问题，不过有什么方法能够确保细胞打到Trizol里面呢？还有这个RNA提取出来以后怎么样看提取的质量呢？我参考的protocol里面是直接进行反转录和PCR，可能是因为单细胞的RNA太少没法检测质量吧，但是这样如果第一步的RNA都没提到的话后面的不是白做了吗？一点头绪都没有啊，求教有经验的大虫，感激不尽！！
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1楼 2013-03-19 09:57:04
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aga0110125

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也在做这个实验，现阶段是DNA的PCR，都是消化后直接扩增的，没法检测模板的质量，我想问问你看的是哪篇protoco，你的基因组扩增又是怎么做的？
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2楼2013-03-19 14:44:17
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炭笔橡皮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by aga0110125 at 2013-03-19 14:44:17
我也在做这个实验，现阶段是DNA的PCR，都是消化后直接扩增的，没法检测模板的质量，我想问问你看的是哪篇protoco，你的基因组扩增又是怎么做的？

Quantitative Estimation of Multiple miRNAs and mRNAs
from a Single Cell
Mugdha V. Joglekar,Chiju Wei,and Anandwardhan A. Hardikar
主要步骤都是按照这个来的。你做出来的结果怎么样呢？提RNA的时候有没有什么特别注意的？我觉得很可能单细胞RNA都提不出来
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3楼2013-03-19 15:53:41
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呼锐

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 炭笔橡皮 at 2013-03-19 15:53:41
Quantitative Estimation of Multiple miRNAs and mRNAs
from a Single Cell
Mugdha V. Joglekar,Chiju Wei,and Anandwardhan A. Hardikar
主要步骤都是按照这个来的。你做出来的结果怎么样呢？提RNA的时候有没 ...

单细胞的现在不是有很多试剂盒可以满足你的实验
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人生就是一个奋斗的过程，只有认真做好每一件小事，才能使成功更近一步！
4楼2013-11-16 21:21:58
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炭笔橡皮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 呼锐 at 2013-11-16 21:21:58
单细胞的现在不是有很多试剂盒可以满足你的实验...

是啊，是有一些，不过那些试剂盒都好贵
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5楼2013-11-17 00:40:46
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kennyhas

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我只做过单细胞的DNA PCR, 我当时是把单细胞在显微镜下挑到96孔板里,挑完了我会在显微镜下看看有没有吹打进去, 你可不可以先把细胞放进96孔里,然后再加trizol呢? 如果不行,建议你可以在反转录之后，real-time PCR之前，设计一对检测非转录区DNA 的引物来做个PCR，这样你就能知道里面有没有基因组DNA在.
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6楼2013-11-17 19:57:42
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炭笔橡皮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by kennyhas at 2013-11-17 19:57:42
我只做过单细胞的DNA PCR, 我当时是把单细胞在显微镜下挑到96孔板里,挑完了我会在显微镜下看看有没有吹打进去, 你可不可以先把细胞放进96孔里,然后再加trizol呢? 如果不行,建议你可以在反转录之后，real-time PCR之 ...

谢谢！我之前是把单细胞打到PCR管里然后再在显微镜下看，但是那个很难聚焦，基本看不出来什么，96孔板会比较明显吗？你做的DNA结果怎么样？
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7楼2013-11-18 09:36:59
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kennyhas

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 炭笔橡皮 at 2013-11-18 09:36:59
谢谢！我之前是把单细胞打到PCR管里然后再在显微镜下看，但是那个很难聚焦，基本看不出来什么，96孔板会比较明显吗？你做的DNA结果怎么样？...

PCR 管里面确实是很难看到， 96孔板可以很方便观察
我之前做DNA PCR可以做出来
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8楼2013-11-22 00:08:50
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炭笔橡皮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by kennyhas at 2013-11-22 00:08:50
PCR 管里面确实是很难看到， 96孔板可以很方便观察
我之前做DNA PCR可以做出来...

好的，我试一下。你做DNA是提纯之后再PCR还是直接在裂解液里面P？
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9楼2013-11-22 10:13:02
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maodoujie

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by kennyhas at 2013-11-17 19:57:42
我只做过单细胞的DNA PCR, 我当时是把单细胞在显微镜下挑到96孔板里,挑完了我会在显微镜下看看有没有吹打进去, 你可不可以先把细胞放进96孔里,然后再加trizol呢? 如果不行,建议你可以在反转录之后，real-time PCR之 ...

你做的DNA的pcr，是用试剂盒还是自己配的反应体系？
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10楼2017-04-18 21:26:32
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