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shiliyusly

新虫 (小有名气)

[求助] 简并引物

大家好，我现在在设计杨梅里己糖激酶的简并引物，想做这个基因的QPCR,主要目的是看这个酶的基因在不同品种杨梅表达的差异。
在ncbi搜索蛋白质序列的时候出现不同种酶（如下图），那这几种是同工酶还是基因家族啊？
我有必要把这所有种的都测序出来吗？最好是能做全吧，那我这简并引物该怎么设计呢？
我现在只设计了一对，在测序中。。。
请高手指教下啊，非常感谢！！！

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@cicelyzh

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1楼2013-03-12 21:36:39
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+3 2013-03-13 13:27:07
从预测的功能来看，至少它们有可能是催化同一反应的，也就是所谓的同工酶。蛋白序列长度差不多，很可能是基因家族。你可以把这几个蛋白序列做一下alignment，看看同源性如何。
简并引物的设计参考
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3011161
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=1841791
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2楼2013-03-12 23:41:13
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-12 23:41:13
从预测的功能来看，至少它们有可能是催化同一反应的，也就是所谓的同工酶。蛋白序列长度差不多，很可能是基因家族。你可以把这几个蛋白序列做一下alignment，看看同源性如何。
简并引物的设计参考
http://emuch.n ...

如果genbank里有5种同工酶，我都想测序的话，我是要分别对这5种蛋白质序列设计简并引物吗？还是设计一对简并引物可能做出P出多种同工酶呢？
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3楼2013-03-13 15:08:52
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-12 23:41:13
从预测的功能来看，至少它们有可能是催化同一反应的，也就是所谓的同工酶。蛋白序列长度差不多，很可能是基因家族。你可以把这几个蛋白序列做一下alignment，看看同源性如何。
简并引物的设计参考
http://emuch.n ...

fructokinase我设计的一对兼并引物的序列测出来了，做了一下blastx,同源性如下图1，后来我又挑选了一些做系统进化树，sequence21是我测出来的序列，感觉有点奇怪，怎么和其他的都离的很远呢，还有一个我设计的基因也有类似情况。这个正常吗？

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4楼2013-03-19 21:43:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

不太清楚是怎么回事。你测序的这个蛋白同源性和其他的序列是多少？此外，其他物种的果糖激酶数目可能不同，参考一下果糖激酶可以分为几个亚型。做tree时应该选取一个相对古老的基因作为outgroup，选取序列时在避免相似重复的前提下尽量选上有代表性的。
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5楼2013-03-20 03:27:35
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-20 03:27:35
不太清楚是怎么回事。你测序的这个蛋白同源性和其他的序列是多少？此外，其他物种的果糖激酶数目可能不同，参考一下果糖激酶可以分为几个亚型。做tree时应该选取一个相对古老的基因作为outgroup，选取序列时在避免相 ...

同源性是92%-95%，就是上面的第一个图最后一个数据。我用的软件是MEGA,这个软件做进化树好吗？另外有人提议说做一个RNA-Seq，不知道效果怎么样
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6楼2013-03-20 09:10:17
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
shiliyusly: 金币+3 2013-03-21 21:27:47
引用回帖:
6楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-03-20 09:10:17
同源性是92%-95%，就是上面的第一个图最后一个数据。我用的软件是MEGA,这个软件做进化树好吗？另外有人提议说做一个RNA-Seq，不知道效果怎么样...

MEGA做树没问题的。我觉得可能是你选序列的问题。可以用RNA做进化树。
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7楼2013-03-20 13:31:02
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jk_xdx

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
shiliyusly: 金币+2 2013-03-21 21:27:43
查几个序列作为参考序列，用alignment （ 建议用ClustalW2，http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ ），需要FASTA格式的序列。得到的结果自己找一致的区域，划完引物用oligo等软件检验下。
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8楼2013-03-21 17:14:41
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jk_xdx at 2013-03-21 17:14:41
查几个序列作为参考序列，用alignment （ 建议用ClustalW2，http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ ），需要FASTA格式的序列。得到的结果自己找一致的区域，划完引物用oligo等软件检验下。

谢谢！我差不多就是按你说的做的。我现在的问题是想把我这个酶的基因的基因家族尽可能都做出来。可是杨梅基因库里已有的基因不多，不知道怎么解决
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9楼2013-03-21 21:27:38
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