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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 超滤更换buffer时损失非常大
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haniel01

铜虫 (初入文坛)

[求助] 超滤更换buffer时损失非常大

如题，用超滤管更换buffer,原来是tris缓冲液的pH是7.9要换成7.2的PBS缓冲液，每次超滤完后损失都将近70%蛋白都没有了，流出液中也没有就是吸附在膜上也弄不下来非常的烦恼蛋白得来不易啊有没有什么办法解决这个问题呢？求助求助啊
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1楼 2013-03-06 11:11:08
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greenygreen

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-03-06 14:01:44
所以很多时候，我宁可通过透析来换缓冲液，几乎没啥损失。要是非得用超滤的话，你最后是倒过来低速离心下来的？还是不倒过来，直接吸取上面的液体的？那种可以倒过来低速离心取得最终样品的还好一些。

能说说您透析的步骤么？我换缓冲液的时候要是透析都会沉淀的很厉害。。。比如我的纯化后的蛋白含有至少200mM的咪唑，要是换成无咪唑的缓冲液，需要梯度透析么？还有就是蛋白需要稀释么？至少要稀释到什么程度？浓度。
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12楼2013-03-06 22:13:08
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xiaomai1215

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-03-06 17:07:24
70%太大了
1.是不是蛋白的总量就比较少，损失大
2.注意蛋白的等电点等性质，更换过程中，蛋白是否发生了聚集沉淀，要经常混匀避免底部浓度过大
3.使用低吸附超滤膜
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haniel01
2楼2013-03-06 13:15:59
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2013-03-06 17:07:34
所以很多时候，我宁可通过透析来换缓冲液，几乎没啥损失。要是非得用超滤的话，你最后是倒过来低速离心下来的？还是不倒过来，直接吸取上面的液体的？那种可以倒过来低速离心取得最终样品的还好一些。
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haniel01
3楼2013-03-06 14:01:44
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haniel01

铜虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaomai1215 at 2013-03-06 13:15:59
70%太大了
1.是不是蛋白的总量就比较少，损失大
2.注意蛋白的等电点等性质，更换过程中，蛋白是否发生了聚集沉淀，要经常混匀避免底部浓度过大
3.使用低吸附超滤膜

总量不算少吧 本来有3mg多的蛋白 超滤完后1mg都没有了，底部浓度过大的话是会吸附在膜上吗？我用的是millipore的，不过不是新的用过几次了跟这个有关系吗？谢谢
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4楼2013-03-06 14:03:49
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