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包子飞扬

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[求助] 微生物长期保存方法已有1人参与

求助各位大虾，微生物除了冷冻保存外，还有什么其他长期保存的方法，简单便于操作的，多谢多谢！

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1楼2013-02-16 10:42:55

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vgyhn

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孢子？

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2楼2013-02-16 11:07:36

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zhangxingc

铁杆木虫 (著名写手)

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9.3 菌种保藏的原理和方法
采用优良的纯种，最好是休眠体（分生孢子、芽孢等），创造一个使微生物代谢不活泼，生长繁殖受抑制，难以突变的环境条件，其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营以及添加保护剂等。
9.3.1 定期移植保藏法
斜面、液体培养基、穿刺等培养成健壮菌体（对数期细胞等）后，将菌种置4℃冰箱保藏，每隔一定时间重新移植培养一次。

表格 15 各种菌定期移植保藏法保藏时间
类型间隔时间备注
芽孢杆菌 3-6个月其它细菌每月一次
放线菌 3个月 4-6℃保藏
酵母菌 4-6个月 4-6℃保藏
类酵母类 1-2个月牙裂酵母、阿氏假囊酵母、棉病囊霉等
丝状真菌 4个月 4-6℃
担子菌 3个月 4-6℃

9.3.2 液体石蜡保藏法
该方法是定期移植保藏法的补充，在生长良好的斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡，液面高出培养基1cm，将其置试管架上以直立状态低温保藏。液体石蜡可以防止水分蒸发、隔绝氧气，所以能延长保藏的时间。但其缺点是必须直立放在冰箱内，占据较大的空间。

图表 3 液体石蜡保藏法示意图
9.3.3 沙管保藏法、土壤保藏法
统称为沙土管法。
沙管保藏法：取河沙过24目筛，用10%-20%的盐酸浸泡除去有机质，洗涤，烘干，分装入安瓿管，加塞灭菌。需要保藏的菌株先用斜面培养基培养，再用无菌水制成细胞或孢子悬液，将10滴悬液注入装有洗净、灭菌河沙的沙管内，使细胞或孢子吸附在沙上，放到干燥器中吸干沙中的水分，将干燥器的沙管用火焰熔封管口，可以室温或低温保藏。
土壤保藏法：以土壤代替河沙，不需酸洗，经风干、粉碎、过24目筛，分装灭菌后，同上制备。
二者的特点是干燥、低温、隔氧、无营养物。保藏效果较好，制作简单，比液体石蜡法保藏时间长。此法适用于芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、放线菌和一些丝状真菌的保藏。保藏时间可达数年，甚至数十年。

图表 4 沙土管保藏示意图
9.3.4 麸皮保藏法
也称曲法保藏，常用于放线菌和霉菌的保藏。将麸皮（也可用谷各种谷物代替）与水或其他培养基成分以一定的比例拌匀。加水或培养液与麸皮的比例为1:0.8或1:1或1:1.5，原则是按照不同菌种对水分要求不同。将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中，装入的麸皮应保持疏松，不要紧压。高温灭菌后，将菌种的孢子液接入，适宜温度下培养，直至长出菌丝，再放干燥器中干燥后，20℃以下温度保藏。也可将小管用火焰熔封。
该法操作简单，菌种保藏时间长，不易退化，工厂中经常采用。
9.3.5 蒸馏水保藏法
最简单的保藏方法。每个试管中装5mL灭菌的无菌水，用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞，接入蒸馏水中并使之悬浮。试管用无菌的橡皮塞塞紧，放置10℃低温保藏。使用时，可从管内移出一环接到培养基上，而原来的管加塞后仍可继续保藏。该法为菌种创造了一个无营养的环境，所以也是一种保藏菌种的好方法。
根据De Vay试验，该法适宜保藏诡谲棒状杆菌（Cornebacterium insidiosum）、根瘤病土壤杆菌（Agrobacterium lumefaciens）、假单胞菌（Pseudomous sp.）等，也有人将其用于酵母菌保藏。
9.3.6 冷冻干燥保藏法
将菌液在冻结状态下升华其中水分，最后获得干燥的菌体样品。同时具备干燥、低温和缺氧的菌种保藏条件，所以可使微生物得到较长时间的保存。
除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外，其他多数微生物，如病毒、细菌、放线菌等都能冻干保藏。许多菌种用此法可保藏10年以上。具体做法，书中有详细记载[26]。

图表 5 冷冻干燥保藏菌种的一般流程
预冻：菌悬液不能有过多的气泡，分装安瓿管后为避免保护剂可能带入的培养基中某些成分或产物的影响，在1h内必须将分装安瓿管放到-30℃以下的超低温冰箱或冻干装置中预冻0.5-1h，然后在真空度0.5mmHg（约66.66Pa）下进行抽干，并逐渐达到0.1-0.2mmHg（约13.33-26.66Pa）。在真空度达到0.2mmHg时水分大量升华，也可以略加温以加快样品中水分升华。当真空度达到0.01mmHg时，一边抽气一边可用喷灯熔封安瓿管口，然后以高频电火花检查各安瓿的真空情况。管内呈灰蓝色光表示已达到真空。检查时电火花应射向安瓿的上半部，切勿直射样品。制成的安瓿管可在4℃冰箱或室温下保藏，且尽量避光保藏。
有些菌种不适宜用冷冻干燥保藏法。安瓿管尺寸见文献[27]。
9.3.7 液氮超低温保藏法
鉴于有些微生物不家采用冷冻干燥法，可以采取此法长期保藏，但少量对低温损伤敏感的微生物除外液氮保藏法的最大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏，不论孢子或菌体、液体培养物或固体培养物均可使用该法。
液氮温度-150℃至-196℃。
关于冷冻结晶的形成过程，请参阅文献[26]。液氮若不幸进入管内，则有很强的爆炸力。
9.3.8 甘油保藏法
此法与液氮超低温保藏法相似。菌种悬浮在10%（体积分数）甘油蒸馏水，置低温（-80℃－-70℃）保藏。该法较简便，保藏期较长，但需要有超低温冰箱。实际工作中，常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中，并使甘油的终浓度在10%-30%左右，再分装于小离心管中，置低温保藏。基因工程菌常采用该法保藏。