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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 10kd 和100kd的蛋白同时做western blot
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章信来

木虫 (正式写手)

[求助] 10kd 和100kd的蛋白同时做western blot已有1人参与

最近在做基因可变剪切的验证实验，预测目标蛋白可变剪切后编码蛋白只有10多KD，而野生型蛋白则有100kd，用常规12%的SDS-PAGE做的WB，结果发现20KD以下就不存在目的片段（PVDF是0.45的，bio-rad湿转，转膜时间是100v*1.5h），是我的转膜时间太长了？PVDF膜孔径太大了？还是要专门的试验方法？
有谁做过类似实验，给个建议！
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1楼2013-01-28 15:49:27
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木花舞

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

有Marker显示20KD附近有那么12%分离胶可以；孔径大转膜时间那么长我觉得10KD的可能转过头了。用0.22um的膜，分别转（我们是200mA）30min和一个半小时试试；可以两张膜转或者放在一张膜上拿出一部分剩下的继续转。。。。
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12楼2015-03-14 20:41:50
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
看天: 金币+3, 鼓励回答 常来啊 2013-01-28 22:41:26
试试缩短转膜时间，我用PVDF，半干法，10 V，1 h，可以同时做出来80 kD和17 kD的
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
2楼2013-01-28 20:31:02
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章信来

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2013-01-28 20:31:02
试试缩短转膜时间，我用PVDF，半干法，10 V，1 h，可以同时做出来80 kD和17 kD的

谢谢，我今天就尝试下！
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3楼2013-01-29 10:58:20
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 鼓励发帖交流 2013-02-01 07:49:42
小蛋白比大蛋白跑得快，无论是电泳还是转膜的时候。觉得你可以做一个10-16%的梯度胶。小蛋白从浓度相对较高的胶里转出来速度会减慢一些。
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4楼2013-01-30 09:29:01
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