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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 片段与载体的连接问题
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Yocan2012

新虫 (小有名气)

[求助] 片段与载体的连接问题

本人自己构建了一个8863bp大小的载体，想要将1900bp大小的目的基因连接到该载体上，使用的内切酶是SmaI/NotI。一开始很容易就连上了，1个月后再进行连接的时候，却在也连不上了。酶切没有问题；连接酶用的是Takara公司的Solution I，应该也没有问题，因为用它连接T载体的效率比较高。
用T载体上面切下来的片段进行连接后，会出现较多连接到T上面的假阳性；如果用PCR产物直接酶切后连接的话，在选择性平板上没有菌落生长。
求高人或者有过同样遭遇的虫友指点。
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1楼 2013-01-18 17:40:52
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loveerobin

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by Yocan2012 at 2013-01-20 16:45:59
我想问，你们做连接用的质粒都是当天提取、酶切、回收、连接的么？我有时候会用放了一段时间的质粒来做连接。...

不用。
放在负20就可以。
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11楼2013-01-20 17:40:15
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
"用T载体上面切下来的片段进行连接后，会出现较多连接到T上面的假阳性"
不明白这是什么意思。你把片段从T载体切下来后不回收片段的吗？为什么还会有连到T载体上的假阳性？
PCR产物做酶切连接没有的话可能是PCR产物酶切不完全。NotI需要6个保护碱基切过夜。
还有，不知道你开始既然很容易连上了，为什么1个月后还要再连呢？
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2楼2013-01-19 08:32:58
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Yocan2012

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-19 08:32:58
"用T载体上面切下来的片段进行连接后，会出现较多连接到T上面的假阳性"
不明白这是什么意思。你把片段从T载体切下来后不回收片段的吗？为什么还会有连到T载体上的假阳性？
PCR产物做酶切连接没有的话可 ...

是从T载体上面切下来的，完全分开后做胶回收，而且回收后的条带很单一。
酶切不完全有可能，但是8个平板一个菌落都不长就不至于了吧？
和一个月前连接的是相同大小的不同基因，而且用的酶切位点是一样的。
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3楼2013-01-19 11:10:35
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by Yocan2012 at 2013-01-19 11:10:35
是从T载体上面切下来的，完全分开后做胶回收，而且回收后的条带很单一。
酶切不完全有可能，但是8个平板一个菌落都不长就不至于了吧？
和一个月前连接的是相同大小的不同基因，而且用的酶切位点是一样的。...

既然你的目的片段是从T载体切下来胶回收的，应该是没什么问题。连接的时候是否做了只有载体不加目的片段的对照？如果这个对照上长很多克隆，说明载体酶切不好。可以从新酶切载体。什么的都不长虽然是理论上的结果，但一般情况下酶切不可能100%，还是会有少许克隆的。如果真的什么都不长，可能是连接酶有问题或者转化失败。
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4楼2013-01-19 12:12:31
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