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ym6104

金虫 (小有名气)

[求助] 长片段的连接转化问题,望大侠们赐教!

新手一枚,现在在扩两个3000bp左右的基因,做TA克隆,PCR的条带很亮,胶回收后跑琼脂糖检测条带也挺亮,用的是TAKARA 的LA TAQ,之后用TAKARA的PMD-19连接过夜,再用全式金的T1感受态转化,涂板之后也长菌了,但没有之前扩短片段的时候多,做菌落PCR检测却什么条带也没有。现在觉得是片段太长没有连接上,所以想请教一下各位,有什么改进的办法吗?还是说得分段扩增,那分段的话在分的片段的太小和引物设计上有什么要求吗?
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ym6104

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 昺昺 at 2013-01-10 20:50:18
既然你能一次把3Kb的片段扩增出来,没有必要再分段扩增。就算分段扩增出来,还是得拼接在一起然后再连接。
我觉得相对于大片段来说,你的连接载体(T载体)可能效率没那么高,我建议换更高效率的连接载体

请问有什么好的推荐吗?我也想换一个试试。
4楼2013-01-10 21:10:24
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昺昺

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
既然你能一次把3Kb的片段扩增出来,没有必要再分段扩增。就算分段扩增出来,还是得拼接在一起然后再连接。
我觉得相对于大片段来说,你的连接载体(T载体)可能效率没那么高,我建议换更高效率的连接载体
太阳出来,星星要走。
2楼2013-01-10 20:50:18
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
ym6104: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-01-11 09:33:37
你做菌落PCR用的什么引物啊?如果是和克隆一样的引物是有可能扩不出来的,从质粒上扩出3000和从菌液中扩出3000还是会有点差别的
一般做菌落PCR一端用载体上的通用引物一端用片段上的引物,片段小一些保证效率
比如一个T7正向+基因5‘端的反向引物  基因3‘端的正向引物+BGH反向引物
这样把方向确定好 选对的测序
3楼2013-01-10 21:05:10
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ym6104

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-10 21:05:10
你做菌落PCR用的什么引物啊?如果是和克隆一样的引物是有可能扩不出来的,从质粒上扩出3000和从菌液中扩出3000还是会有点差别的
一般做菌落PCR一端用载体上的通用引物一端用片段上的引物,片段小一些保证效率
比如 ...

用的是和克隆一样的引物,PCR程序也是一样的。。。跑出来什么东西都没有。。
5楼2013-01-10 21:12:49
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