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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 长片段的连接转化问题，望大侠们赐教！
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ym6104

金虫 (小有名气)

[求助] 长片段的连接转化问题，望大侠们赐教！

新手一枚，现在在扩两个3000bp左右的基因，做TA克隆，PCR的条带很亮，胶回收后跑琼脂糖检测条带也挺亮，用的是TAKARA 的LA TAQ，之后用TAKARA的PMD-19连接过夜，再用全式金的T1感受态转化，涂板之后也长菌了，但没有之前扩短片段的时候多，做菌落PCR检测却什么条带也没有。现在觉得是片段太长没有连接上，所以想请教一下各位，有什么改进的办法吗？还是说得分段扩增，那分段的话在分的片段的太小和引物设计上有什么要求吗？
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1楼 2013-01-10 19:32:34
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

draco1987

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-10 21:05:10
你做菌落PCR用的什么引物啊？如果是和克隆一样的引物是有可能扩不出来的，从质粒上扩出3000和从菌液中扩出3000还是会有点差别的
一般做菌落PCR一端用载体上的通用引物一端用片段上的引物，片段小一些保证效率
比如 ...

我也来补充一下，TA克隆是不分方向连接的，如果楼主只是要测序验证一下，可以考虑可以把片段反向连进载体的情况也考虑进去，但是这样就会有4对引物组合要检测
其实pMD19-T载体本身不大，连3000bp的片段有些力不从心，楼主如果以后还要继续大量搞，还是尽快改变策略吧，要么分段连，要么换别的合适的载体。
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13楼2013-01-11 11:23:22
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普通回帖

昺昺

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
既然你能一次把3Kb的片段扩增出来，没有必要再分段扩增。就算分段扩增出来，还是得拼接在一起然后再连接。
我觉得相对于大片段来说，你的连接载体（T载体）可能效率没那么高，我建议换更高效率的连接载体
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太阳出来，星星要走。
2楼2013-01-10 20:50:18
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ym6104: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-01-11 09:33:37
你做菌落PCR用的什么引物啊？如果是和克隆一样的引物是有可能扩不出来的，从质粒上扩出3000和从菌液中扩出3000还是会有点差别的
一般做菌落PCR一端用载体上的通用引物一端用片段上的引物，片段小一些保证效率
比如一个T7正向+基因5‘端的反向引物  基因3‘端的正向引物+BGH反向引物
这样把方向确定好 选对的测序
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3楼2013-01-10 21:05:10
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ym6104

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 昺昺 at 2013-01-10 20:50:18
既然你能一次把3Kb的片段扩增出来，没有必要再分段扩增。就算分段扩增出来，还是得拼接在一起然后再连接。
我觉得相对于大片段来说，你的连接载体（T载体）可能效率没那么高，我建议换更高效率的连接载体

请问有什么好的推荐吗？我也想换一个试试。
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4楼2013-01-10 21:10:24
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ym6104

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-10 21:05:10
你做菌落PCR用的什么引物啊？如果是和克隆一样的引物是有可能扩不出来的，从质粒上扩出3000和从菌液中扩出3000还是会有点差别的
一般做菌落PCR一端用载体上的通用引物一端用片段上的引物，片段小一些保证效率
比如 ...

用的是和克隆一样的引物，PCR程序也是一样的。。。跑出来什么东西都没有。。
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5楼2013-01-10 21:12:49
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by ym6104 at 2013-01-10 21:12:49
用的是和克隆一样的引物，PCR程序也是一样的。。。跑出来什么东西都没有。。...

那就是了，菌液扩3k出不来是有可能的，你换对引物扩一下
或者直接测序吧，两头测一个反应先
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6楼2013-01-10 22:14:43
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kangqx2212

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
直接测序吧，两头测一个反应先。
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7楼2013-01-10 22:26:13
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ym6104

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by kangqx2212 at 2013-01-10 22:26:13
直接测序吧，两头测一个反应先。

嗯嗯，明天重做一遍，直接测序试试。
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8楼2013-01-10 23:00:17
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ym6104

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-10 22:14:43
那就是了，菌液扩3k出不来是有可能的，你换对引物扩一下
或者直接测序吧，两头测一个反应先...

嗯嗯，明天重做一遍，直接测序试试。
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9楼2013-01-10 23:00:25
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ym6104

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-10 22:14:43
那就是了，菌液扩3k出不来是有可能的，你换对引物扩一下
或者直接测序吧，两头测一个反应先...

直接测序指的是PCR产物直接测还是说把菌液拿去呢？
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10楼2013-01-10 23:02:18
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