应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 长片段的连接转化问题，望大侠们赐教！
181/2返回列表12下一页
查看: 2052  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

ym6104

金虫 (小有名气)

[求助] 长片段的连接转化问题，望大侠们赐教！

新手一枚，现在在扩两个3000bp左右的基因，做TA克隆，PCR的条带很亮，胶回收后跑琼脂糖检测条带也挺亮，用的是TAKARA 的LA TAQ，之后用TAKARA的PMD-19连接过夜，再用全式金的T1感受态转化，涂板之后也长菌了，但没有之前扩短片段的时候多，做菌落PCR检测却什么条带也没有。现在觉得是片段太长没有连接上，所以想请教一下各位，有什么改进的办法吗？还是说得分段扩增，那分段的话在分的片段的太小和引物设计上有什么要求吗？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-01-10 19:32:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

draco1987

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-10 21:05:10
你做菌落PCR用的什么引物啊？如果是和克隆一样的引物是有可能扩不出来的，从质粒上扩出3000和从菌液中扩出3000还是会有点差别的
一般做菌落PCR一端用载体上的通用引物一端用片段上的引物，片段小一些保证效率
比如 ...

我也来补充一下，TA克隆是不分方向连接的，如果楼主只是要测序验证一下，可以考虑可以把片段反向连进载体的情况也考虑进去，但是这样就会有4对引物组合要检测
其实pMD19-T载体本身不大，连3000bp的片段有些力不从心，楼主如果以后还要继续大量搞，还是尽快改变策略吧，要么分段连，要么换别的合适的载体。
赞一下(1人) 回复此楼
13楼2013-01-11 11:23:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

昺昺

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
既然你能一次把3Kb的片段扩增出来，没有必要再分段扩增。就算分段扩增出来，还是得拼接在一起然后再连接。
我觉得相对于大片段来说，你的连接载体（T载体）可能效率没那么高，我建议换更高效率的连接载体
赞一下 回复此楼
太阳出来，星星要走。
2楼2013-01-10 20:50:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ym6104: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-01-11 09:33:37
你做菌落PCR用的什么引物啊？如果是和克隆一样的引物是有可能扩不出来的，从质粒上扩出3000和从菌液中扩出3000还是会有点差别的
一般做菌落PCR一端用载体上的通用引物一端用片段上的引物，片段小一些保证效率
比如一个T7正向+基因5‘端的反向引物  基因3‘端的正向引物+BGH反向引物
这样把方向确定好 选对的测序
赞一下 回复此楼
3楼2013-01-10 21:05:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ym6104

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 昺昺 at 2013-01-10 20:50:18
既然你能一次把3Kb的片段扩增出来，没有必要再分段扩增。就算分段扩增出来，还是得拼接在一起然后再连接。
我觉得相对于大片段来说，你的连接载体（T载体）可能效率没那么高，我建议换更高效率的连接载体

请问有什么好的推荐吗？我也想换一个试试。
赞一下 回复此楼
4楼2013-01-10 21:10:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ym6104

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-10 21:05:10
你做菌落PCR用的什么引物啊？如果是和克隆一样的引物是有可能扩不出来的，从质粒上扩出3000和从菌液中扩出3000还是会有点差别的
一般做菌落PCR一端用载体上的通用引物一端用片段上的引物，片段小一些保证效率
比如 ...

用的是和克隆一样的引物，PCR程序也是一样的。。。跑出来什么东西都没有。。
赞一下 回复此楼
5楼2013-01-10 21:12:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by ym6104 at 2013-01-10 21:12:49
用的是和克隆一样的引物，PCR程序也是一样的。。。跑出来什么东西都没有。。...

那就是了，菌液扩3k出不来是有可能的，你换对引物扩一下
或者直接测序吧，两头测一个反应先
赞一下 回复此楼
6楼2013-01-10 22:14:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kangqx2212

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
直接测序吧，两头测一个反应先。
赞一下 回复此楼
7楼2013-01-10 22:26:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ym6104

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by kangqx2212 at 2013-01-10 22:26:13
直接测序吧，两头测一个反应先。

嗯嗯，明天重做一遍，直接测序试试。
赞一下 回复此楼
8楼2013-01-10 23:00:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ym6104

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-10 22:14:43
那就是了，菌液扩3k出不来是有可能的，你换对引物扩一下
或者直接测序吧，两头测一个反应先...

嗯嗯，明天重做一遍，直接测序试试。
赞一下 回复此楼
9楼2013-01-10 23:00:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ym6104

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-10 22:14:43
那就是了，菌液扩3k出不来是有可能的，你换对引物扩一下
或者直接测序吧，两头测一个反应先...

直接测序指的是PCR产物直接测还是说把菌液拿去呢？
赞一下 回复此楼
10楼2013-01-10 23:02:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 ym6104 的主题更新
181/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 7/350 2026-08-31 00:21 by hZiFeudZyoGR
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 8/400 2026-08-31 00:21 by hZiFeudZyoGR
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 4FFAWE8HcgUD 2026-08-29 4/200 2026-08-30 20:40 by hZiFeudZyoGR
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 zICmwzsBXjbN 2026-08-29 5/250 2026-08-30 20:08 by hZiFeudZyoGR
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 jCd0dEvKHShX 2026-08-29 4/200 2026-08-30 19:57 by hZiFeudZyoGR
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +5 jCd0dEvKHShX 2026-08-29 7/350 2026-08-30 19:45 by hZiFeudZyoGR
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 jCd0dEvKHShX 2026-08-29 4/200 2026-08-30 19:35 by hZiFeudZyoGR
[博后之家] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 4/200 2026-08-30 18:28 by hZiFeudZyoGR
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 6/300 2026-08-30 17:25 by hZiFeudZyoGR
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 7/350 2026-08-30 17:03 by hZiFeudZyoGR
[基金申请] 面上意见出来了 +9 黄鸟于飞Chao 2026-08-29 18/900 2026-08-30 16:47 by 黄鸟于飞Chao
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 4/200 2026-08-30 06:57 by ZPa0EcMwuECS
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +12 Kittylucky 2026-08-27 13/650 2026-08-29 00:04 by superceng
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 基金未中，这种答复是模板吗？ +5 zhaosm1982 2026-08-27 6/300 2026-08-27 16:00 by lfy8008
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +23 koalala 2026-08-24 26/1300 2026-08-26 14:29 by 宝贝虫子
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭