应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 长片段的连接转化问题，望大侠们赐教！
52/1返回列表
查看: 2044  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

ym6104

金虫 (小有名气)

[求助] 长片段的连接转化问题，望大侠们赐教！

新手一枚，现在在扩两个3000bp左右的基因，做TA克隆，PCR的条带很亮，胶回收后跑琼脂糖检测条带也挺亮，用的是TAKARA 的LA TAQ，之后用TAKARA的PMD-19连接过夜，再用全式金的T1感受态转化，涂板之后也长菌了，但没有之前扩短片段的时候多，做菌落PCR检测却什么条带也没有。现在觉得是片段太长没有连接上，所以想请教一下各位，有什么改进的办法吗？还是说得分段扩增，那分段的话在分的片段的太小和引物设计上有什么要求吗？
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2013-01-10 19:32:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

draco1987

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-10 21:05:10
你做菌落PCR用的什么引物啊？如果是和克隆一样的引物是有可能扩不出来的，从质粒上扩出3000和从菌液中扩出3000还是会有点差别的
一般做菌落PCR一端用载体上的通用引物一端用片段上的引物，片段小一些保证效率
比如 ...

我也来补充一下，TA克隆是不分方向连接的，如果楼主只是要测序验证一下，可以考虑可以把片段反向连进载体的情况也考虑进去，但是这样就会有4对引物组合要检测
其实pMD19-T载体本身不大，连3000bp的片段有些力不从心，楼主如果以后还要继续大量搞，还是尽快改变策略吧，要么分段连，要么换别的合适的载体。
赞一下(1人) 回复此楼
13楼2013-01-11 11:23:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答

昺昺

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
既然你能一次把3Kb的片段扩增出来，没有必要再分段扩增。就算分段扩增出来，还是得拼接在一起然后再连接。
我觉得相对于大片段来说，你的连接载体（T载体）可能效率没那么高，我建议换更高效率的连接载体
赞一下 回复此楼
太阳出来，星星要走。
2楼2013-01-10 20:50:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ym6104: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-01-11 09:33:37
你做菌落PCR用的什么引物啊？如果是和克隆一样的引物是有可能扩不出来的，从质粒上扩出3000和从菌液中扩出3000还是会有点差别的
一般做菌落PCR一端用载体上的通用引物一端用片段上的引物，片段小一些保证效率
比如一个T7正向+基因5‘端的反向引物  基因3‘端的正向引物+BGH反向引物
这样把方向确定好 选对的测序
赞一下 回复此楼
3楼2013-01-10 21:05:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ym6104

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 昺昺 at 2013-01-10 20:50:18
既然你能一次把3Kb的片段扩增出来，没有必要再分段扩增。就算分段扩增出来，还是得拼接在一起然后再连接。
我觉得相对于大片段来说，你的连接载体（T载体）可能效率没那么高，我建议换更高效率的连接载体

请问有什么好的推荐吗？我也想换一个试试。
赞一下 回复此楼
4楼2013-01-10 21:10:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 4/200 2026-08-29 04:18 by gy1nBQXYQJqL
[教师之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 4/200 2026-08-29 04:06 by gy1nBQXYQJqL
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 4/200 2026-08-29 03:58 by gy1nBQXYQJqL
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +16 爱看书的可乐 2026-08-26 18/900 2026-08-29 00:28 by winsaint
[基金申请] 麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上） +4 gdd2018 2026-08-28 9/450 2026-08-28 14:22 by jklily
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +3 bud_bud 2026-08-27 6/300 2026-08-28 11:53 by bud_bud
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 申请删除本帖 +6 lyz123lyz 2026-08-27 7/350 2026-08-27 17:31 by 宁静致远sy
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
[职场人生] 学生撞见辅导员送外卖，第二天全班都沉默了 +3 鲸鱼融金_浙江_� 2026-08-22 3/150 2026-08-26 09:01 by zzuzxg
[基金申请] 国合现在查不到了吗？ +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 明天应该可查了！？ +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[基金申请] 某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭