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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DNA测序问题
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jasminezhao

金虫 (小有名气)

[求助] DNA测序问题

最近在做重组子的构建，可是做完转化后，提取的质粒为什么浓度很低只有几十ng/ui，这个是什么原因跟跳的单克隆菌落的大小有关系吗？还有就是送去测序为什么得到的序列结果非常少只有三四百个bp，这是什么原因？希望大家能给宝贵意见，都做了三四个月了还是无结果，真的急疯了，谢谢各位了！！
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1楼 2013-01-04 20:50:11
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jasminezhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by dongrh1981 at 2013-01-06 11:29:52
测序返回的结果可能有1.4～1.5kb，但是能够清楚辨识并且有效和正确的序列一般只有700nt～800nt左右，一个测序反应一般有效读长只有700nt左右，这是业内公认的，也是目前应用sanger测序法仪器的性能极限。...

恩，但是我想知道的是为什么相同的治理测的结果相差这么大，就是之前得到了一千四五百bp么后来去测就得到三四百bo,想请教一下是什么原因，谢谢！！
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14楼2013-01-07 08:57:06
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xingxingsf

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-05 17:38:24
做完转化的平板上长出的菌落是很小，所以要先划到新的平板上养一夜，长多点再提质粒，理论上即使挑很小的菌落在液体LB培养基里养一夜也能长到10的9次方左右了，足够提质粒了。你很少的原因可能是转化效率低，重组质粒没转进去？
测序一个反应就400bp左右，你的片段长的话可以要求公司测通，再拼接起来就行了。
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2楼2013-01-04 21:13:43
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
浓度和你的质粒毒性/复制位点有关，低copy质粒就几十ng/ul，不过也够用了。

测序300-400是不是符合你预期的序列？ 这个和质粒质量（杂质）/测序引物/质粒多少有关
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3楼2013-01-05 03:42:48
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-05 17:38:36
你用的手提质粒还是盒子提？如果的低拷贝质粒，盒子提就是几十ng/ul。如果希望浓度高就多摇些菌。挑很小的克隆摇菌过夜提质粒也足够的。
高质量的测序一个反应可以读600-700nt，但是后面的分辨率也不是很好，400nt是正常的。当然，如果模板质量高，测序出来的结果会更漂亮，读出来的也稍微长一点。但也不会超过我说的那个数目了。如果你的序列长，需要多个引物测，再把序列拼接起来。
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4楼2013-01-05 08:57:31
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