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湘雨儿1

金虫 (小有名气)

[求助] 克隆求助

用pGEM@-T载体做克隆，DNA浓度最小要多少呢，为什么我做的蓝白斑假阳性那么多，感受态细胞的量和复苏是加培养基的量影响很大吗？按照说明书上的结果一般会最好吗？
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1楼 2012-12-31 09:54:58
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
少加质粒，多加产物，假阳性会少吧。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2012-12-31 10:14:25
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nangyingyuan

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
DNA浓度没有很高的要求，适量就行
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3楼2012-12-31 10:23:56
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湘雨儿1

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-31 10:14:25
少加质粒，多加产物，假阳性会少吧。

我已经加了很多的产物了，3.4uL 产物和0.8uL载体
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4楼2012-12-31 10:23:58
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湘雨儿1

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by nangyingyuan at 2012-12-31 10:23:56
DNA浓度没有很高的要求，适量就行

我的OD值只有2~3之间也没问题吗？
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5楼2012-12-31 10:42:05
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
湘雨儿1: 金币+1 2012-12-31 12:16:54
引用回帖:
4楼: Originally posted by 湘雨儿1 at 2012-12-31 10:23:58
我已经加了很多的产物了，3.4uL 产物和0.8uL载体...

那你有百分之多少假的？10微升体系，我就加0.5微升载体。
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6楼2012-12-31 11:19:59
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
T-vector放久了也会自连的。如果你假阳性多可能是载体不好了。
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7楼2012-12-31 13:21:33
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greenygreen

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
蓝白斑本来就不靠谱。。。还有就是纠正下上面的回复，加入量不是看体积，而是看摩尔数。根据你的T载体和你要连进去的目的片段的分子量和浓度，计算出摩尔数。根据，目的片段：载体=1:6或者1:10的相对量构建连接体系。才能保障连接的效率和重组子的数量。这也是TAKARA T4 DNA ligase说明书上要求的。
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8楼2013-01-02 10:42:05
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lxbxk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
DNA的浓度没有要求，连接产物和载体的摩尔比在10：1的时候比较好，反正有一点必须保证连接产物的摩尔数一定要高于载体的摩尔数，假阳性高还有一个原因就是抗生素的抗性或者晒蓝白班的那个试剂有可能失效，或者你没有避光什么的也可能会导致。。。
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做开心的自己，加油
9楼2013-01-02 10:55:45
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