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Runyu

金虫 (小有名气)

[求助] 关于超滤离心管的使用问题

买了两个30KD的超滤离心管，这个一般装入多少mL物料液？用完后用什么溶剂洗涤？我在百度中没查到，也没有产品说明书，还请有经验的人赐教。先谢谢了。
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1楼 2012-12-20 13:41:11
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l_x_m莫惹

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
liusir3836: 回帖置顶 2013-05-18 13:32:45
Runyu(liusir3836代发): 金币+10, 博学EPI+1, 楼主长时间未给予奖励！由版主代发金币10枚！感谢对本版的贡献！ 2013-05-18 13:34:19
Millipore厂家一共提供3KD、10KD、30KD、50KD、100KD五种超滤离心管，容量分别有0.5ml、4ml、15ml三种，
蛋白浓缩和换Buffer通常使用的超滤管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超滤管（MWCO10kD）。也有其它型号 的、不同体积大小和MWCO超滤管可选，视目的蛋白的分子量与浓缩前体积、浓缩目标体积而定。可重复使用，使用一次就扔掉太浪费。以下是个人总结的使用方 法和注意事项：
1、选择合适的超滤管，主要考虑MWCO和浓缩体积，最常见的是Ultra-15（10kD）。到底选择多大截留分子量比较合适呢？10kDa、 5kDa、还是30kDa？通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为35kDa，就可以选择10kDa截留分子量的超滤管。若目的蛋白分子量为10kD左右，则可以用截留分子量3kD的超滤管。认真阅读使用说明书，注意超滤膜对各种化学物质的耐受程度有所不同，表格中有。
  2、新买来的超滤是干燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全过膜，冰浴或冰箱里预冷几分钟。然后将水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超过管顶的白线为准。操作要轻，加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。
  3、平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快，否则直接损坏超滤膜。开始离心超滤（离心机预冷至4度）。不同离心机的转速 rpm换算成g之后，有所不同。具体可参阅附件里的说明书。离心机的加速度调至最低档，减小对膜的压力。注意，一定要等离心机达到目的转速之后，方可离开 离心机，否则离心机出问题时，无法第一时间处理，后果不可预测！膜与转轴的方向根据说明书调整（角转离心机的情况是膜与轴垂直）。在实际使用中，一般转速 开的比说明书里的要低，这样可以延长离心管的使用寿命。
  4、当浓缩到剩下1ml时，【取50ul国产Bradford溶液，加入10ul流穿，看有没变蓝色，以此判断超滤管是否漏掉蛋白。如果管漏了，将上层和流穿重新倒入新管中开始超滤。要精确判断是否漏管，用5mgml的BSA离心10min，再取流穿，跑蛋白胶或Bradford粗测】，继续加入剩下的蛋白液浓缩（在冰上操作，防止蛋白受热），直到所有浓缩液都加完为止。离心过程中注意是否发生蛋白沉淀，导致堵管。若发生沉淀，要确定沉淀的具体原因，是蛋白浓度过高还是Buffer不合适；前者可用多根超滤管同时超滤，降低浓度的办法解决，后者的方法是换不同的Buffer，直到蛋白不发生沉淀为 止。
  5、前面几步用以浓缩蛋白，如果要换Buffer，在总蛋白液浓缩至1ml左右的时候，轻轻加入新的Buffer（经0.22um超滤膜超滤），再 浓缩至1ml左右，连续三次，最后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定，一般不多于500ul，也有浓缩至200ul以内的情况。按照每次至少10倍 左右的体积浓缩算，三次达到1000倍以上，基本上可以达到换buffer的目的。
  6、取出最终蛋白浓缩液的操作在冰上操作，用黄枪头（200ul）取，轻轻顺着边缘插入枪头，轻轻吹打、混匀蛋白液，注意不要碰到超滤膜，然后吸取 浓缩液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最后一点浓缩液不必吸取，否则难度太大，有可能损坏超滤膜。最后加入MilliQ水到超滤管中，没过 超滤膜，防止膜失水变干。
  7、以下是处理超滤管，重复利用超滤管的步骤。
  8、倒出超滤管里的水，用milliQ水轻轻润洗几次，【若管底有可见的蛋白沉淀，可以先加入水，然后用枪头吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉淀悬起，然后倒掉，不可用自来水猛冲】然后加入0.2M的NaOH溶液，室温放置20min，期间平衡超滤管。再离心10min。倒出残留的NaOH溶液，将 管芯浸入MilliQ水的烧杯(1或2L)中,放置几个小时,再换新的水,放置几个小时，不断稀释NaOH浓度。50ml管和盖子用自来水洗，内壁再用 MilliQ水洗干净。
  9、取出浸没的管芯，加至接近满的MilliQ水，50ml管也加满MilliQ水，将管芯慢慢放入50ml离心管，排出部分水，然后盖上盖子，放4度保存，直到下次使用。一般来说，按照上述步骤和注意事项，每根管用三四年不会坏。
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3楼2012-12-20 18:38:51
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戴维奇奇

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wolfghost: 金币+1, 有奖问答！ 2012-12-20 14:17:15
Runyu(liusir3836代发): 金币+2, 楼主长时间未给予奖励！由版主代发金币2枚！感谢对本版的贡献！ 2013-05-18 13:35:08
三分之二的，反正过半就行，不要超过三分之二了。至于用什么洗还是鉴于你用了什么东西，反正我们这边一般都用有机溶液洗。实在不行就用王水洗那个洗的超干净的
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心有多大舞台就有多大
2楼2012-12-20 13:51:34
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mirongsheng

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by l_x_m莫惹 at 2012-12-20 18:38:51
Millipore厂家一共提供3KD、10KD、30KD、50KD、100KD五种超滤离心管，容量分别有0.5ml、4ml、15ml三种，
蛋白浓缩和换Buffer通常使用的超滤管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超滤管（MWCO10kD）。也有其它型号 的 ...

介绍的好详细，学习了！谢谢！
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mi
4楼2013-04-09 15:33:23
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yingjie1985

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
Runyu(liusir3836代发): 金币+4, 楼主长时间未给予奖励！由版主代发金币4枚！感谢对本版的贡献！ 2013-05-18 13:35:39
找到两个资料不知，是不是你需要的，希望可以有用
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  • 附件 1 : 蛋白超滤膜的使用.doc
    • 2013-04-10 16:53:55, 37 K
  • 附件 2 : 超滤管使用方法和注意事项.doc
    • 2013-04-10 16:54:08, 23.5 K
将心比心，以心换心，你怎样对我，我就怎样对你！从今以后 ！嘴要甜，心要狠。该留留，该滚滚。 要么忍，要么狠，要么滚。
5楼2013-04-10 16:54:53
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