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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pcr测序后发现有重叠现象
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Cllair

金虫 (小有名气)

[求助] pcr测序后发现有重叠现象

提取出来基因，跑胶后条带很亮，切胶回收后去测序，发现有重叠现象，已经纯化分离测序了很多次了每次都是有重叠现象，实在不知道怎么办呢，请诸位指点一下吧。还有就是我想把该基因直接和t载体连接后去测质粒，这样是不是会好一点呢。江湖急救，高手帮忙啊。
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有今生没来世，且行且珍惜。
1楼 2012-12-11 22:16:23
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Cllair

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by joan198108 at 2012-12-14 14:32:37
两种可能：模板本身不纯；引物特异性不高。最近我碰到过后面情况，换引物后解决了。

单纯的根据基因库资料设计的引物，其实p基因的时候成功率就很低。现有资料引物就只能设计到这个水平了。。。
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有今生没来世，且行且珍惜。
13楼2012-12-14 16:26:52
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
最好还是连载体吧，可能是引物不太好！
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2楼2012-12-11 22:17:33
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR产物是有可能不是单一序列，跑胶一条带只能说明分子量很接近。连到载体上挑单克隆再去测序比较保险。
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3楼2012-12-12 08:09:11
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Cllair

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 追梦的人1987 at 2012-12-11 22:17:33
最好还是连载体吧，可能是引物不太好！

我也觉得引物不太好，十次会有九次p不成功，但是相关资料少，引物就能设计到这个份上了。谢谢了哈。
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有今生没来世，且行且珍惜。
4楼2012-12-12 16:00:06
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