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applexixixi木虫 (小有名气)
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[求助]
IPTG诱导表达的问题
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各位朋友，有谁做过大肠杆菌的IPTG诱导表达？我有一些问题想咨询一下。 1，是不是一定要把大肠培养到对数期再加IPTG诱导？具体OD值是多少有明确要求吗？ 2，我的表达质粒是pUC18加了我的目的基因，不同质粒对IPTG诱导表达有什么影响吗？我看文献用pET系列的很多，这个区别大吗？ 3，要表达不同的目的基因，诱导的具体条件是不是不同呢？都需要做哪些条件的优化？比如菌的OD值，IPTG浓度，诱导时间都需要做吗？ 哪位朋友有现成的实验方案最好了，希望能分享一下。 |
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tete1987
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11楼2013-03-07 21:29:35
czdaeq
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【答案】应助回帖
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首先，IPTG浓度诱导一般可以在对数初期（OD,得需要你测生长曲线再定了）进行，这个时候菌体活性不错，扛得住；但是对于一些特殊要求的实验，比如表达的基因对于底物的利用很关键，那么需要一接种就诱导，要不然涨不起来的（但是这类一般就采用组成型，不用诱导型了）。 IPTG浓度，严格来说每种质粒（比如PUC18在MCS区插基因）都只需要探索一次即可（有的载体有的基因型最适表达量是不同滴）； 至于条件的摸索，一般先按文献试试，只有不如人意时，才摸索看看有没有改进，一般不是一上来就做这么多滴！ |
2楼2012-12-11 10:09:15
【答案】应助回帖
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30个金币啊，可真真是不少的财物，见钱心喜了。 根据我多年IPTG诱导表达，主要是摇瓶的诱导表达经验(发酵罐我们不用IPTG了)来大致地阐述一下： (1)质粒复制，蛋白诱导表达都是一个耗能的过程，会消耗宿主菌的ATP，因此增加了宿主菌的代谢负荷，抑制了宿主菌本身的生长繁殖。 (2)IPTG诱导表达其实没有严格OD600nm限定范围，不过很多人喜欢在对数初期(OD600nm=0.3-0.6)进行诱导，因为这个时候菌活力最高，诱导表达增加的负荷完全承受的住，并且菌体这个时候不会产生大量的副代谢产物，因此有利于产物表达和菌体繁殖。 (3)个人喜欢在对数后期或者平稳期(OD600nm=2-3)诱导表达。对数初期诱导表达菌量不高，IPTG浓度相对较高，增加的负荷较大，因此最终诱导完毕菌体量较低，大概2-3左右。对数后期诱导菌体量较高，IPTG浓度相对较低，减少了负荷，最终菌体量较高。最重要的是对数后期诱导有利于结构蛋白 折叠，形成正确的结构，原理可能是后期诱导菌体蛋白表达速率下降，菌体各种辅助蛋白折叠的产物较多，因而有利于获得可溶性蛋白。 (4)最后一点，不管是那个时期诱导，必然能获得你需要的蛋白。摇瓶体系中，大肠杆菌能完全承受IPTG诱导表达，无需多虑。 |
3楼2012-12-11 14:31:10
sxxuan
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4楼2012-12-11 15:13:58
