| 查看: 11777 | 回复: 12 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
applexixixi木虫 (小有名气)
|
[求助]
IPTG诱导表达的问题
|
|
|
各位朋友，有谁做过大肠杆菌的IPTG诱导表达？我有一些问题想咨询一下。 1，是不是一定要把大肠培养到对数期再加IPTG诱导？具体OD值是多少有明确要求吗？ 2，我的表达质粒是pUC18加了我的目的基因，不同质粒对IPTG诱导表达有什么影响吗？我看文献用pET系列的很多，这个区别大吗？ 3，要表达不同的目的基因，诱导的具体条件是不是不同呢？都需要做哪些条件的优化？比如菌的OD值，IPTG浓度，诱导时间都需要做吗？ 哪位朋友有现成的实验方案最好了，希望能分享一下。 |
回复此楼» 猜你喜欢
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有87人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
tete1987
银虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 395.9
- 帖子: 111
- 在线: 106.8小时
- 虫号: 1238753
- 注册: 2011-03-19
- 专业: 微生物生理与生物化学
11楼2013-03-07 21:29:35
czdaeq
铜虫 (著名写手)
- 应助: 22 (小学生)
- 金币: 2512.1
- 散金: 3990
- 红花: 6
- 帖子: 1712
- 在线: 161.2小时
- 虫号: 1672565
- 注册: 2012-03-07
- 专业: 微生物学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2012-12-11 20:11:59
applexixixi: 金币+10, ★有帮助 2012-12-18 11:14:52
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2012-12-11 20:11:59
applexixixi: 金币+10, ★有帮助 2012-12-18 11:14:52
|
首先，IPTG浓度诱导一般可以在对数初期（OD,得需要你测生长曲线再定了）进行，这个时候菌体活性不错，扛得住；但是对于一些特殊要求的实验，比如表达的基因对于底物的利用很关键，那么需要一接种就诱导，要不然涨不起来的（但是这类一般就采用组成型，不用诱导型了）。 IPTG浓度，严格来说每种质粒（比如PUC18在MCS区插基因）都只需要探索一次即可（有的载体有的基因型最适表达量是不同滴）； 至于条件的摸索，一般先按文献试试，只有不如人意时，才摸索看看有没有改进，一般不是一上来就做这么多滴！ |
2楼2012-12-11 10:09:15
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2012-12-11 20:12:57
applexixixi: 金币+15, ★★★很有帮助, 谢谢你 2012-12-18 11:15:37
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2012-12-11 20:12:57
applexixixi: 金币+15, ★★★很有帮助, 谢谢你 2012-12-18 11:15:37
|
30个金币啊，可真真是不少的财物，见钱心喜了。 根据我多年IPTG诱导表达，主要是摇瓶的诱导表达经验(发酵罐我们不用IPTG了)来大致地阐述一下： (1)质粒复制，蛋白诱导表达都是一个耗能的过程，会消耗宿主菌的ATP，因此增加了宿主菌的代谢负荷，抑制了宿主菌本身的生长繁殖。 (2)IPTG诱导表达其实没有严格OD600nm限定范围，不过很多人喜欢在对数初期(OD600nm=0.3-0.6)进行诱导，因为这个时候菌活力最高，诱导表达增加的负荷完全承受的住，并且菌体这个时候不会产生大量的副代谢产物，因此有利于产物表达和菌体繁殖。 (3)个人喜欢在对数后期或者平稳期(OD600nm=2-3)诱导表达。对数初期诱导表达菌量不高，IPTG浓度相对较高，增加的负荷较大，因此最终诱导完毕菌体量较低，大概2-3左右。对数后期诱导菌体量较高，IPTG浓度相对较低，减少了负荷，最终菌体量较高。最重要的是对数后期诱导有利于结构蛋白 折叠，形成正确的结构，原理可能是后期诱导菌体蛋白表达速率下降，菌体各种辅助蛋白折叠的产物较多，因而有利于获得可溶性蛋白。 (4)最后一点，不管是那个时期诱导，必然能获得你需要的蛋白。摇瓶体系中，大肠杆菌能完全承受IPTG诱导表达，无需多虑。 |
3楼2012-12-11 14:31:10
sxxuan
金虫 (著名写手)
- MolEPI: 4
- 应助: 107 (高中生)
- 金币: 3442.4
- 散金: 104
- 红花: 17
- 帖子: 1478
- 在线: 266.1小时
- 虫号: 512865
- 注册: 2008-02-27
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
4楼2012-12-11 15:13:58
