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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请问有谁用过millipore的超滤管？
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tianhui725

铜虫 (初入文坛)

[求助] 请问有谁用过millipore的超滤管？

我想测细胞分泌的细胞因子，用millipore的超滤管将我需要的蛋白滤出，但是为什么相同体积（5ml）的上清，同时离心，剩下的液体体积却不同？有些剩下三百微升，有些五百微升。我该怎么控制将其条件设置成相同啊？求高人指点。
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1楼 2012-12-03 22:28:12
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tianhui725

铜虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-04 08:00:12
浓缩的速度不会完全一样，样品中的蛋白浓度、杂质颗粒、缓冲液组分都有一定影响。最终的体积很难精确控制，如果体积大的样品，就稍微多离心一会。

浓缩前提取每种细胞的上清都是5ml，相同时间浓缩后所剩的毫升数不同，那么我以浓缩后的上清来做细胞因子的表达水平，进行对比的话，是不是已经不准确了？
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4楼2012-12-04 10:33:46
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tianhui725

铜虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by hbgdzscc at 2012-12-04 08:44:39
管没用过，膜用过，可能与清洗不好有关，清洗终点要有量化的判断标准。不知道超滤时，你压力、时间等因素如何掌控。

超滤时，压力机时间都是一样的。清洗终点如何量化啊？不精确了啊。求教。
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5楼2012-12-04 10:35:09
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tianhui725

铜虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-04 08:00:12
浓缩的速度不会完全一样，样品中的蛋白浓度、杂质颗粒、缓冲液组分都有一定影响。最终的体积很难精确控制，如果体积大的样品，就稍微多离心一会。

蛋白浓度高剩下的多一些，还是蛋白浓度低剩下的多一些呢？盼回复。
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6楼2012-12-04 11:20:24
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tianhui725

铜虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-04 14:43:07
如果体系相同，当然是浓度高的浓缩起来更慢。如果你觉得不好定量，可以用缓冲液把样品稀释成相同体积，比方说500ul，或者300ul。...

样品是相同体积的，但是离心半小时以后就有些多有些少了。
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9楼2012-12-05 08:55:07
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tianhui725

铜虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by hallen6891 at 2012-12-04 15:10:12
你用的应该是15ml的那种超滤管吧，如果是新管子的话，应该不会出现这种问题的，我之前做过，但是当你用过几次之后，由于它上面的滤膜会吸附一些杂质，如果你清洗不彻底的话，就会改变其透过能力，导致你说的这种情况 ...

我用的是15ml的，是新的，不同细胞系提取的上清，都是5ml，离心半小时后所剩下的体积不同。可能我表述有误，我要的东西在上面。我现在就把滤得慢得再离心一会儿，只能达到每种差不多一致。不知这样对蛋白浓度有没有很大的影响啊。
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10楼2012-12-05 08:57:21
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tianhui725

铜虫 (初入文坛)
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11楼: Originally posted by hallen6891 at 2012-12-05 09:29:02
哦，不同细胞系所分泌的蛋白成分不一样的，那你出现这种情况应该正常，会对蛋白浓度有一定的影响，不过如果你的蛋白大小距离膜孔径较远（40KDa对应3KDa），那影响不大。超滤之后，计算好你的稀释倍数！祝试验顺利！...

只能大概计算一下了，做不到那么精确。每种最后控制在两百微升。谢谢啦！
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12楼2012-12-05 15:52:29
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tianhui725

铜虫 (初入文坛)
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13楼: Originally posted by 天蛇2012 at 2012-12-05 17:15:32
如果上清成份不完全相同当然会出现浓度后所剩体积不同，但是你可以自定一个量，不如浓缩5倍，哪个先到了就先取出，剩下的继续离心就可以了...

嗯。我现在就是这么做的，只能看那个刻度，大概判断一下。谢谢！
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14楼2012-12-06 20:46:40
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