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buzaimihuo

金虫 (小有名气)

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专业: 细胞死亡

[求助] 请做过C2C12 细胞双向电泳的朋友帮帮我吧已有1人参与

有没有哪个虫子做过C2C12 CELL 的双向电泳，因为自己所有的程序都是按照GE公司说明书上做的，包括配溶液、试剂，选择的是11cm的PH 3-10NL的胶条，但做了很长时间，始终做不出来，即使做出来点也极少，尤其是碱性端几乎没有点，请问是什么原因呢？如果有做出来的，希望您不吝赐教，咱们可以细聊！
   好几天都没有回复，那我就把自己的实验细节发上来，另有图片，希望大家帮帮我，多谢啦！
一、样品制备：（C2C12贴壁细胞，100mm平皿）
（1）培养细胞的收集；
（2）用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞3 次（室温，2000g， 2min）；再用250mM的蔗糖洗3次，彻底吸干残留的蔗糖-山梨醇（5.48%）,
（3）将细胞分装到1.5ml Eppendorf 管中
（4）加入裂解缓冲液(8M尿素，4%CHAPS，10mM/mlPMSF,40mMDTT)300ul.
（5）冰浴超声约1min（超声2s，间隔8s）
(6） 4°C，12,000g，离心1h，吸取上清,置于新的EP管中，于-80℃中保存。
二、Bradford法测蛋白浓度
取15个0.2ml的小离心管，其中12个做两个标准平行
0.1mg/mlBSA体积（ul） 10       8       6       4          2       0
水化液体积（ul）       0       2       4       6          8       10
BSA浓度（mg/ml）    0.1 0.08    0.06 0.04       0.02    0
再做3个重复，将样品用水化液稀释10倍（每一管1ul样品+9ul水化液），用微型离心机离心约1min,再吸取至96孔的细胞培养板中，每个孔再加入200ul的CBB,约5min,用酶标仪在595nm测吸光度。测出的蛋白质浓度约为4mg/ml.

三、水化上样
1、从冰箱中取-20冷冻保存的水化上样缓冲液（(8M尿素，2%CHAPS)一小管(500ul)，置室温溶解。
2、在小管中加入DTT(约为2.8mg/ml),颠倒混匀。
3、从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（11cm pH3-10NL）,于室温放置10分钟。
4、取出-80℃中的蛋白样品(4℃离心12，000g,5min)，上样600ug,根据所测浓度量取体积，并加入相应体积的水化液（总体积为240ul）,被动水化14h
四、一向（仪器为Ettan IPGphor3）
程序为S1 100V  stp 1h;
      S2 200V  stp 1h;
      S3 500V  stp 1h;
      S4 1000V stp 1h;
      S5 6000V Grd 2h ;
      S6 6000V 35000vhr Grd
      S7 500V  stp 15h

五、二向(电泳仪为GE的SE600 Ruby)
1、平衡，按75 mMTris-HCl pH 8.8, 6 M urea, 2% SDS, 29.3% glycerol（v/v） and 1% DTT 平衡 15min, 再用上述缓冲液（不加DTT）加入2.5%IAA 平衡15min.
2、12%SDS-PAGE，10mA/一块胶持续15min,15mA/一块胶跑到底。
但做过很多遍，跑出来的点都很少，尤其是在碱性端，几乎没有点，可见图片（ PH 3-10，图片左侧为碱性端）[ Last edited by buzaimihuo on 2012-12-2 at 20:29 ]

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