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月落星沉

银虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by laoboshihou at 2012-11-29 09:33:25
millipore的超最方便。可否考虑用真空干燥的方法,用离心机干燥的方法。

真空干燥是怎么操作?要什么设备?
11楼2012-11-29 10:45:34
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月落星沉

银虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by zq347597638 at 2012-11-29 10:44:13
买个好的透析袋,用蔗糖或者聚乙二醇覆盖在上面快速吸水  处理  (蔗糖烘干后可以反复使用)

好吧,我试试,看起来不需要什么特别的设备,还蛮方便的。
12楼2012-11-29 10:53:52
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yongbo_liang

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
月落星沉: 金币+3, 有帮助 2012-12-01 14:35:31
直接用硫酸铵沉淀,1小时内搞定,然后用缓冲液溶解出来:
1。脱盐:如果盐影响你蛋白的离子交换柱的吸附,就脱盐。
2.不脱盐,可直接稀释1-2倍,直接上离子交换柱,并不影响吸附,同时体积也小的多,也就10-50ml之间吧。

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13楼2012-11-29 16:14:47
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月落星沉

银虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
13楼: Originally posted by yongbo_liang at 2012-11-29 16:14:47
直接用硫酸铵沉淀,1小时内搞定,然后用缓冲液溶解出来:
1。脱盐:如果盐影响你蛋白的离子交换柱的吸附,就脱盐。
2.不脱盐,可直接稀释1-2倍,直接上离子交换柱,并不影响吸附,同时体积也小的多,也就10-50ml之 ...

盐析我试过,沉淀总是溶解不完全,总有白色的细密的粉末状的东西。我都用了100多ml的缓冲液了,还是溶不掉。后来我把它们离心下来,再加缓冲液,还是不溶,不过新加的缓冲液也可以测到酶活。你知不知道这是怎么回事?
还有就是上柱子前的脱盐,用的是透析的方法,可是泡2天透析袋就破了。。。
14楼2012-12-01 14:31:05
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william9798

铜虫 (小有名气)

强烈建议冷冻干燥
15楼2012-12-01 15:44:30
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qianshengguo

铜虫 (小有名气)

“之前还试过盐析的方法替代,但不知道为什么,透析除盐的时候,透析袋总是很容易就破了(像是被溶解了似的,透析2天后,看着好好的,轻轻一碰就破掉了)"
你用的大概多少ml的透析袋,装了多少蛋白液?
我猜可能是你蛋白装的量太多了,而且蛋白浓度较高,盐析时量较大,那重量把透析袋撑破了,你可以考虑用多个透析袋同步进行。而且你直接透析了2天?你可以考虑中途换透析袋啊。
16楼2012-12-04 14:09:30
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月落星沉

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
16楼: Originally posted by qianshengguo at 2012-12-04 14:09:30
“之前还试过盐析的方法替代,但不知道为什么,透析除盐的时候,透析袋总是很容易就破了(像是被溶解了似的,透析2天后,看着好好的,轻轻一碰就破掉了)"
你用的大概多少ml的透析袋,装了多少蛋白液?
我猜 ...

一般是装半管或者或2/3管,透析袋使用的部分大概20cm长,宽度是21mm,这个量装太多了吗?
17楼2012-12-05 09:52:27
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月落星沉

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by zq347597638 at 2012-11-29 10:44:13
买个好的透析袋,用蔗糖或者聚乙二醇覆盖在上面快速吸水  处理  (蔗糖烘干后可以反复使用)

貌似蔗糖混进去了
18楼2012-12-05 09:53:57
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小李爱学习

铜虫 (正式写手)

先用硫酸铵分级沉淀,沉淀出来后加少量缓冲液溶解,然后透析出去硫酸铵,一定要注意透析袋不要装超过二分之一,用进口透析袋和进口透析夹。透析后再上柱子才行。
如果硫酸铵无法沉淀出来(蛋白浓度过低),就先冷冻干燥,再加适量缓冲液溶解(这一步是为了提高蛋白质浓度,只有蛋白浓度达到1mg/ml的时候,硫酸铵沉淀才有较好的效果),然后再加硫酸铵沉淀。
19楼2013-04-01 20:09:11
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小李爱学习

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
14楼: Originally posted by 月落星沉 at 2012-12-01 14:31:05
盐析我试过,沉淀总是溶解不完全,总有白色的细密的粉末状的东西。我都用了100多ml的缓冲液了,还是溶不掉。后来我把它们离心下来,再加缓冲液,还是不溶,不过新加的缓冲液也可以测到酶活。你知不知道这是怎么回事 ...

硫酸铵沉淀的时候一定要慢慢加,不用把硫酸铵沉淀;不溶的就不要了,也许是变性的蛋白。
20楼2013-04-01 20:17:55
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