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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白刺激RAW264.7，Elisa检测TNF-α的释放
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758836596

铜虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白刺激RAW264.7，Elisa检测TNF-α的释放

我用蛋白刺激RAW264.7，24h之后Elisa检测TNF-α的释放，结果发现阴性对照也就是只往细胞里加PBS而不加蛋白刺激，竟然可以检测到大量的TNF-α的释放，请做过这种实验的老师给指导一下吧，谢谢了！我培养细胞的培养基里面加入了血清，会不会是因为这个原因啊？跟细胞的状态有关系吗？或者是和铺板的细胞数太多有关系？
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1楼 2012-11-19 15:06:24
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蓝天_1988

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
758836596: 金币+2, ★有帮助 2012-11-20 13:44:35
wizardfan: 金币+3, 感谢细致的分析 2012-12-24 08:59:02
1、血清里面有很多刺激因素，一般实验时都需要饥饿一段时间（即用无血清培养基培养；时间根据自己的实验情况定，可以查查相关文献）；
2、细胞量要保证板与板之间没有差别；
3、如果做到上述1、2后还是control不成立的话，需要做个预实验(检测所用溶剂中是否合格，尤其是水)了。
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2楼2012-11-19 17:49:50
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758836596

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 蓝天_1988 at 2012-11-19 17:49:50
1、血清里面有很多刺激因素，一般实验时都需要饥饿一段时间（即用无血清培养基培养；时间根据自己的实验情况定，可以查查相关文献）；
2、细胞量要保证板与板之间没有差别；
3、如果做到上述1、2后还是control不成 ...

饥饿一段时间是什么意思啊？是铺板的时候都用无血清培养基吗？还是先用加了血清的培养基培养细胞一段时间，等细胞贴壁良好之后再换无血清培养基呢？文献很少说这么细的东西，谢谢您啊。
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3楼2012-11-20 13:48:35
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蓝天_1988

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
看天: 金币+2, 鼓励 常来 2012-11-20 21:02:20
引用回帖:
3楼: Originally posted by 758836596 at 2012-11-20 13:48:35
饥饿一段时间是什么意思啊？是铺板的时候都用无血清培养基吗？还是先用加了血清的培养基培养细胞一段时间，等细胞贴壁良好之后再换无血清培养基呢？文献很少说这么细的东西，谢谢您啊。...

铺板时还是用有血清的培养基培养，等细胞贴壁良好后再换无血清培养基，换无血清培养基培养一段时间（我一般做的时候>16h），然后在进行处理。
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4楼2012-11-20 17:02:49
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宁夏8083

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
看天: 金币+4, 鼓励 常来 2012-11-20 21:02:34
758836596: 金币+4, ★有帮助 2012-11-21 13:35:55
我觉得问题是这样的：
1 你先检测一下PBS和培养基，里面是不是含有内毒素，这个可以用鲎试剂检测，市面上卖的很多，不贵，大约100元/盒吧。因为RAW264.7 对内毒素（LPS）比较敏感，我们实验室原来做的时候都是用内毒素-free的水；
2 铺板的时候，细胞数量很重要的，太多了有死细胞也会引起培养体系的改变，导致内源性的TNF增多；
3 可以铺板的时候用正常量的血清，随后贴壁好，换用无血清的培养基饥饿一段，我们叫同步化，使细胞都处于同一个细胞周期，这样背景比较均一，这个在细胞周期试验中比较常用。
4 剩下的就是实验操作过程中的细心了。不可能对照组比处理组都高，还是哪些细节没有注意到吧。
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5楼2012-11-20 18:40:18
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宁夏8083

铁杆木虫 (正式写手)
我原来用LPS刺激的时候，没有出现这种情况，都是对照孔是阴性的结果。
对了，有没有这种可能：你的蛋白是抑制TNF的产生的？
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6楼2012-11-20 18:42:31
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758836596

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 宁夏8083 at 2012-11-20 18:40:18
我觉得问题是这样的：
1 你先检测一下PBS和培养基，里面是不是含有内毒素，这个可以用鲎试剂检测，市面上卖的很多，不贵，大约100元/盒吧。因为RAW264.7 对内毒素（LPS）比较敏感，我们实验室原来做的时候都是用内 ...

谢谢了！
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7楼2012-11-21 13:39:37
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758836596

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 宁夏8083 at 2012-11-20 18:42:31
我原来用LPS刺激的时候，没有出现这种情况，都是对照孔是阴性的结果。
对了，有没有这种可能：你的蛋白是抑制TNF的产生的？

文献上LPS的浓度也不是很一致，请问您用的浓度时多大啊？ELISA时样品稀释多少倍比较好呢？谢谢！
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8楼2012-11-21 13:42:10
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758836596

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 宁夏8083 at 2012-11-20 18:42:31
我原来用LPS刺激的时候，没有出现这种情况，都是对照孔是阴性的结果。
对了，有没有这种可能：你的蛋白是抑制TNF的产生的？

就算是抑制，阴性对照也不该这么高啊，着急。
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9楼2012-11-21 15:00:08
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蓝天_1988

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
wizardfan: 金币+1, 谢谢分享经验 2012-12-24 09:00:18
引用回帖:
5楼: Originally posted by 宁夏8083 at 2012-11-20 18:40:18
我觉得问题是这样的：
1 你先检测一下PBS和培养基，里面是不是含有内毒素，这个可以用鲎试剂检测，市面上卖的很多，不贵，大约100元/盒吧。因为RAW264.7 对内毒素（LPS）比较敏感，我们实验室原来做的时候都是用内 ...

LPS我用的最高是400EU
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10楼2012-11-21 19:46:25
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