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dongyan08

木虫 (正式写手)

[求助] 发酵纯化

本人一直以来都是做分子的,现在老板打算做蛋白纯化了,对这行太生了,所以请教各位大侠:
如果我要小规模的纯化蛋白一般用什么方法?我查了文献,很多是用亲和层析和分子筛、阴离子交换层析的方法,应该根据什么原则来选择方法呢?这些方法是有配套的平衡液吗?还是根据自己的蛋白性质来选择?
如果大规模的纯化,是不是应该用发酵罐发酵,发酵之后又得用什么方法纯化呢?疏水层析和阳离子交换层析?这都应该如何选择呢?有没有什么具体流程?
请各位熟悉这方面的大侠赐教!!万分感激!!!!
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匿名

用户注销 (知名作家)

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2楼2012-11-10 00:15:22
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

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没有具体流程的,只能是自己摸索,要真的说流程,那就是粗提-细分。
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
3楼2012-11-10 00:25:48
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fan127

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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先把要的蛋白从发酵液里提到溶液溶解了,液体状态比较好去杂质.然后过滤,萃取,超滤纳滤,层析电泳等等,看文献吧.得有hplc作检测了.知道你要的东西的性质最好.

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
4楼2012-11-10 16:49:37
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zjl01234

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

要分离纯化首先得摸清楚蛋白的一些性质吧,这样才好根据性质来设计路线,方法很多,也得适合你的蛋白
5楼2012-11-12 23:22:33
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wzq_ing

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

工业生产当然要发酵的,一般都是发酵后浓缩,粗提,再做纯化,具体的操作要根据自己目标蛋白性质来确定
6楼2012-11-13 08:33:14
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dongyan08

木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by zjl01234 at 2012-11-12 23:22:33
要分离纯化首先得摸清楚蛋白的一些性质吧,这样才好根据性质来设计路线,方法很多,也得适合你的蛋白

我要纯化的蛋白大小为78KD,带有HIS标签,亲水,我想用镍离子金属鳌合(Ni-NTA)亲和层析纯化,然后用子筛sephadex G-75凝胶层析,最后目的蛋白的离心超滤浓缩,这样设计可以吗?
7楼2012-11-13 11:11:14
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魂断生物

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我觉得如果是发酵的话,还要看你所要纯化的蛋白是胞外蛋白还是胞内蛋白,如果是胞内蛋白,还要先对细胞进行破壁将蛋白释放出来。据我了解,亲和层析特异性很强,一般用亲和层析洗脱下来后可以接着进行浓缩。许多都是指导性原则,纯化方案还是要经过实验摸索。
8楼2012-11-13 11:38:19
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

HIS-tag还是比较好弄的哈,特异性比较强,洗脱液不怎么复杂~只要楼主蛋白能够大量表达,不会沉淀不会形成包涵体,那就胜利一半了……
9楼2012-11-13 14:11:04
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seanzhu1996

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

His-tag的蛋白还是比较好纯化的,不过大规模发酵的时候工艺需要建立,和摇瓶的条件肯定不同。一般做的好的话,发酵罐上的产量会提高。剩下的分离提取就是常规化的流程了。
享受每天的生活
10楼2012-11-21 13:28:38
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