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bingdong05

银虫 (正式写手)

[求助] 求助:平末端链接的具体方法 已有1人参与

最近要构建质粒,但是悲催的是由于载体已经链接多个片段,所剩多克隆位点不多,且所剩的多克隆位点目的片段上全有,所以只能采用平末端链接,而这方面没有做过,望做过的虫友们不吝赐教,多谢!
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titus0805

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
宝生物有去磷酸化的试剂盒,载体酶切后去磷酸化,目的片段切下来,混合,连接,转化,测序
4楼2012-11-07 09:24:14
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shuishui007

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1.平末端链接容易自连,因此要将质粒载体去磷酸化;2.平末端链接可以正向连,也可能反向连,因此要鉴定方向;3.其他的同粘性末端链接。
2楼2012-11-07 08:31:22
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bingdong05

银虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by shuishui007 at 2012-11-07 08:31:22
1.平末端链接容易自连,因此要将质粒载体去磷酸化;2.平末端链接可以正向连,也可能反向连,因此要鉴定方向;3.其他的同粘性末端链接。

具体的操作方法呢,兄弟
3楼2012-11-07 08:56:37
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shuishui007

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

1. 将质粒用你所要的内切酶酶切后,回收。
2. 用去磷酸化酶酶切,按说明书完成就可以了(比如宝生物公司就有三种这样的酶)。
3. 去磷酸化后的质粒与目的片段按1:5~10的摩尔比连接。
4. 酶切或菌体PCR检测连接方向。
5楼2012-11-09 20:13:42
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