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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助：平末端链接的具体方法
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bingdong05

银虫 (正式写手)

[求助] 求助：平末端链接的具体方法已有1人参与

最近要构建质粒，但是悲催的是由于载体已经链接多个片段，所剩多克隆位点不多，且所剩的多克隆位点目的片段上全有，所以只能采用平末端链接，而这方面没有做过，望做过的虫友们不吝赐教，多谢！
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1楼2012-11-06 21:51:13
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shuishui007

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.平末端链接容易自连，因此要将质粒载体去磷酸化；2.平末端链接可以正向连，也可能反向连，因此要鉴定方向；3.其他的同粘性末端链接。
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2楼2012-11-07 08:31:22
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bingdong05

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shuishui007 at 2012-11-07 08:31:22
1.平末端链接容易自连，因此要将质粒载体去磷酸化；2.平末端链接可以正向连，也可能反向连，因此要鉴定方向；3.其他的同粘性末端链接。

具体的操作方法呢，兄弟
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3楼2012-11-07 08:56:37
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titus0805

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
宝生物有去磷酸化的试剂盒，载体酶切后去磷酸化，目的片段切下来，混合，连接，转化，测序
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4楼2012-11-07 09:24:14
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shuishui007

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

1. 将质粒用你所要的内切酶酶切后，回收。
2. 用去磷酸化酶酶切，按说明书完成就可以了（比如宝生物公司就有三种这样的酶）。
3. 去磷酸化后的质粒与目的片段按1：5~10的摩尔比连接。
4. 酶切或菌体PCR检测连接方向。
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5楼2012-11-09 20:13:42
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ytetyio09

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可以试试这篇论文的方法，虽然是个小的改进，但是值得一试，而且很方便：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256
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6楼2014-03-25 19:10:44
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ytetyio09 at 2014-03-25 19:10:44
可以试试这篇论文的方法，虽然是个小的改进，但是值得一试，而且很方便：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256

看到了你分享的paper
这个东西有一定的风险，在连接体系中，尤其是平末端，因为片段可以自己跟自己连起来，变得很大。这样很有可能多份连接的片段赶上了载体的大小，如果是这样，判断哪个是载体+片段的条带有就一定难度。。。当然，如果相差很大的载体和片段，应该不会有问题。
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7楼2014-03-25 19:36:47
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