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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 药代动力学 » 组织分布样品制备方法
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梦不落张

铜虫 (小有名气)

[求助] 组织分布样品制备方法

最近在做五种成分在大鼠肾组织分布实验，样品制备方法为：将大鼠肾称重，加4倍10%氨水-生理盐水，剪碎匀浆，取组织匀浆液400ul，加500ng/ml混标和内标各50ul，加2倍量甲醇(1ml)，涡旋10min，离心（13000rpm，10min，4℃）后取上清液1ml，加10%氨水-生理盐水1ml，加3ml乙酸乙酯，涡旋10分钟后离心（3000rpm，10min，4℃），取上清液50℃氮气吹干，加500ul10%乙腈复溶，13000rpm,4℃离心15min,取上清液进样。
问题：样品复溶离心后溶液上层有混悬液体，曾试过用0.22um滤膜过滤进样但过滤后两种成分检测不出。也试过只取中间澄清层进样，但柱子前端筛板堵了，求各位高手相助解决下样品制备方法啊!
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1楼 2012-11-06 11:01:46
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wangyuanji

银虫 (小有名气)
★
PSA: 金币+1, 赞 2012-12-06 13:00:56
乙醚麻醉处死大鼠，经左心室心脏灌注，至流出液几乎无血色。取脑。剥除脑膜，称重，按1:1（w/v）加入生理盐水手动匀浆，匀浆液置于5毫升EP管中，12000RPM/5MIN。取上清500微升，加有机溶剂萃取，涡旋，离心，取上层有机相，减压挥干溶剂，少量甲醇复溶（浓集），涡旋，高速离心，进样测定。
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梦不落张
心态比能力重要
5楼2012-11-07 16:13:08
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wangyuanji

银虫 (小有名气)
我是同时测定四种成分，有水溶性的，也有脂溶性的。之前我做的时候也没有做心脏灌注，后来老师说，脑中有残余血液，会影响脑组织中待测成分的测定，所以我就采用了灌注，效果很明显，取出的脑组织明显变白。向你请教一下啊，如果测定的化合物水溶性较差，取上清有问题吗？你是怎么考虑的呢？
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心态比能力重要
8楼2012-11-08 20:16:13
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梦不落张

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wangyuanji at 2012-11-08 20:16:13
我是同时测定四种成分，有水溶性的，也有脂溶性的。之前我做的时候也没有做心脏灌注，后来老师说，脑中有残余血液，会影响脑组织中待测成分的测定，所以我就采用了灌注，效果很明显，取出的脑组织明显变白。向你请教 ...

如果你有脂溶性的成分，最好不要取组织匀浆液的生理盐水上清，我做过实验，取上清和取组织匀浆液的制样后分析，取上清的含量要明显低于取组织匀浆液的。
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9楼2012-11-12 15:40:41
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wangyuanji

银虫 (小有名气)
★
jiangchunyong: 金币+1, 谢谢 2012-11-07 14:55:00
没有做过肾脏的，做过脑的。挥干溶剂，复溶，进样前高速离心，没有混悬。会不会是肾脏特有的不易被高速离心去除掉的油状物质？不然，你试试肾脏灌注，将肾脏中残余的尿液等物质冲洗干净，再进行匀浆处理。没有做过，所以只能说这么多。祝你好运！
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心态比能力重要
2楼2012-11-06 22:04:49
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梦不落张

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wangyuanji at 2012-11-06 22:04:49
没有做过肾脏的，做过脑的。挥干溶剂，复溶，进样前高速离心，没有混悬。会不会是肾脏特有的不易被高速离心去除掉的油状物质？不然，你试试肾脏灌注，将肾脏中残余的尿液等物质冲洗干净，再进行匀浆处理。没有做过， ...

可以具体说下你怎么处理的脑吗
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3楼2012-11-07 08:54:37
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kkbyb

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
使用的复溶溶剂溶解性对待测物来说合适吗？
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4楼2012-11-07 14:39:48
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梦不落张

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by kkbyb at 2012-11-07 14:39:48
使用的复溶溶剂溶解性对待测物来说合适吗？

复溶溶剂是初始流动相
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6楼2012-11-08 14:34:08
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梦不落张

铜虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by wangyuanji at 2012-11-07 16:13:08
乙醚麻醉处死大鼠，经左心室心脏灌注，至流出液几乎无血色。取脑。剥除脑膜，称重，按1:1（w/v）加入生理盐水手动匀浆，匀浆液置于5毫升EP管中，12000RPM/5MIN。取上清500微升，加有机溶剂萃取，涡旋，离心，取上层 ...

谢了，你要测定的化合物是水溶性的吗？我看你是取得匀浆液的上清。我的实验没做心脏灌注，因为取了血样，有什么影响吗？
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7楼2012-11-08 14:41:51
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wangyuanji

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 梦不落张 at 2012-11-12 15:40:41
如果你有脂溶性的成分，最好不要取组织匀浆液的生理盐水上清，我做过实验，取上清和取组织匀浆液的制样后分析，取上清的含量要明显低于取组织匀浆液的。...

谢谢你的回复啊！确实，我打算取组织匀浆液测定试试。因为四种成分中有两种没有检测到。
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心态比能力重要
10楼2012-11-12 20:30:18
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