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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重组质粒转化，板子上总长杂菌
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674515734

铜虫 (小有名气)

[求助] 重组质粒转化，板子上总长杂菌

做质粒重组，做了好多次了，转化后板子上总是长很多杂菌。昨天转化涂板，总共长了9个菌落，全部挑菌培养，只有两个个摇出了，提质粒双酶切，却看不到小条带。
请问各位，板子总长杂菌会是哪里污染了？连接反应用的水都是灭完菌没用过的，加感受态细胞什么的也是在超净台操作，感受态细胞师姐们都在用，应该没有问题，板子是在4°冰箱放置。求解。。。。。。
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在卑微中活出精彩，在短暂中寻求永恒。。。
1楼 2012-11-06 10:51:14
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674515734

铜虫 (小有名气)
板子是十月份做的，到现在有二十天。插入的片段有750bp左右，如果切下来应该是能看到的。我在想是不是我操作过程中污染了，例如双酶切后割胶回收。
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在卑微中活出精彩，在短暂中寻求永恒。。。
3楼2012-11-06 15:51:20
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-06 17:26:12
如果感受态没问题的话，是不是抗生素失效了。此外，你的插入片段很小吗？特别小的片段酶切后不是很容易看到，用0.3-0.5ug质粒做酶切，把整个体系都点进去。实在不行PCR鉴定一下。
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2楼2012-11-06 11:29:14
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 674515734 at 2012-11-06 15:51:20
板子是十月份做的，到现在有二十天。插入的片段有750bp左右，如果切下来应该是能看到的。我在想是不是我操作过程中污染了，例如双酶切后割胶回收。

750bp应该比较容易看的。你提出的质粒有没有做个单酶切和载体质粒比较，分子量大小对吗？
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4楼2012-11-07 07:53:22
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674515734

铜虫 (小有名气)
质粒提完后跑了一下，条带是正确的。前天挑了所有的菌落，有一个摇出来了，这次双酶切我切了四个小时，看到小片段了。
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在卑微中活出精彩，在短暂中寻求永恒。。。
5楼2012-11-07 11:32:36
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