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674515734

铜虫 (小有名气)

[求助] 重组质粒转化,板子上总长杂菌

做质粒重组,做了好多次了,转化后板子上总是长很多杂菌。昨天转化涂板,总共长了9个菌落,全部挑菌培养,只有两个个摇出了,提质粒双酶切,却看不到小条带。
请问各位,板子总长杂菌会是哪里污染了?连接反应用的水都是灭完菌没用过的,加感受态细胞什么的也是在超净台操作,感受态细胞师姐们都在用,应该没有问题,板子是在4°冰箱放置。求解。。。。。。
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在卑微中活出精彩,在短暂中寻求永恒。。。
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-06 17:26:12
如果感受态没问题的话,是不是抗生素失效了。此外,你的插入片段很小吗?特别小的片段酶切后不是很容易看到,用0.3-0.5ug质粒做酶切,把整个体系都点进去。实在不行PCR鉴定一下。
2楼2012-11-06 11:29:14
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674515734

铜虫 (小有名气)

板子是十月份做的,到现在有二十天。插入的片段有750bp左右,如果切下来应该是能看到的。我在想是不是我操作过程中污染了,例如双酶切后割胶回收。
在卑微中活出精彩,在短暂中寻求永恒。。。
3楼2012-11-06 15:51:20
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 674515734 at 2012-11-06 15:51:20
板子是十月份做的,到现在有二十天。插入的片段有750bp左右,如果切下来应该是能看到的。我在想是不是我操作过程中污染了,例如双酶切后割胶回收。

750bp应该比较容易看的。你提出的质粒有没有做个单酶切和载体质粒比较,分子量大小对吗?
4楼2012-11-07 07:53:22
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674515734

铜虫 (小有名气)

质粒提完后跑了一下,条带是正确的。前天挑了所有的菌落,有一个摇出来了,这次双酶切我切了四个小时,看到小片段了。
在卑微中活出精彩,在短暂中寻求永恒。。。
5楼2012-11-07 11:32:36
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haofei123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
是不是操作过程出现了问题,例如是不是加的抗生素失活?尤其是在倒平板的时候培养基过热?
6楼2012-11-07 22:45:04
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