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[求助]
与多糖相关的前辈们帮帮忙啊
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| 本人做多糖提取的相关实验，现在已经提到了粗多糖，接下来该怎么办呢？老师说让先在薄层板上跑板，他说的什么意思啊？ |
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prtong
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7楼2013-04-08 09:26:48
小毛孩24
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2楼2012-11-05 22:46:52
【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
2320: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢您的帮助！ 2012-11-06 10:17:53
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你只做了提取得到了一个混合物接下来要纯化 1、脱蛋白和色素。 2、色谱柱纯化 3、分子量测定 4、结构确定 一、提取 样品处理：洗净，晾干、磨碎、过筛( 80 目) 1、热水提法 料液比＝1∶（20-30）有报道1:30最好，90℃时浸提2h，反复浸提2次，5000r／min离心15min，残渣水洗后重复离心一次，合并上清液，经减压浓缩(60℃)。 2、稀酸提法 在60-70℃用料液比1∶20、pH 2。0.17mol/L-HCl（pH＝2） 的稀盐酸提取两次，每次2h，离心，合并上清液用碱（NaOH）中和。 以上两个方法可以辅助超声波。辅助条件：物料比为1：30，提取时间为30min，温度为60-70℃，pH为7．超声波频率以低频好，高频率会使多糖分子断裂。 二、脱蛋白分离多糖 根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用V（氯仿）∶V（戊醇或正丁醇）为5∶1或4∶1（滤液:氯仿：正丁醇=25：（4、5）：1），混合物剧烈振摇20～30min，蛋白质变性生成凝胶，离心分离，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质.此种只能除去少量蛋白质，效率不高，须反复多次，多糖有损失.但此方法比较温和，在避免多糖降解上效果较好，如配合加入一些蛋白质水解酶，用Sevage法效果更佳。Sevage 法和酶法联用除蛋白即先添加0.1%的木瓜蛋白酶，在pH 6.5、50℃条件下酶解2h，再用Sevage 法反复脱蛋白6 次，直到中间层无沉淀产生为止，收集上层液，透析( 透析袋截留相对分子质量3000u) 截留液减压浓缩，加乙醇（3倍体积95%乙醇）至浓度为70%，静置沉淀。生成沉淀经丙酮、乙醚、无水乙醇依次洗涤（可除去色素），真空冷冻干燥得粗多糖。 注：除褐藻酸：取上述粗多糖溶解于蒸馏水中，加入终浓度为0.05mol /L 的CaCl2和20% 的乙醇，室温放置过夜使沉淀完全， 3000r /min 离心20min，弃去粗多糖中的褐藻酸钙沉淀。 三、纯化 1、纤维素阴离子交换柱层析DEAE‐cellulose 最常见的交换剂为DEAE－纤维素（硼酸型或碱型），洗脱剂可用不同浓度的碱溶液、硼砂溶液、盐溶液等。此方法目前最为常用。它一方面可纯化多糖，另一方面还适于分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖。 多糖溶液加入DEAE－52层析柱上端，分别用浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mol /L NaCl 溶液进行梯度洗脱，流速为1.0mL /min，以6mL /管进行样品收集。苯酚－硫酸法在480nm 处跟踪检测吸光度，绘制洗脱曲线，透析、浓缩、冷冻干燥，可以得到不同分子量的多糖。 2、凝胶柱层析 根据多糖分子的大小和形状不同进行分离。常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)及琼脂糖凝胶(Sepharose)。多糖分离时多选用Sephadex G—50以分离相对分子量在1万以下的各组分，然后选用Sephadex G-150-200进一步纯化。展层剂为各种浓度的盐溶液及缓冲液，一般用0．1mol／L NaCl。 (20×430mm)，用苯酚—硫酸法进行检测，收集糖反应阳性高峰部分，醇沉，干燥，即得纯化的多糖。 要注意的是，对多糖的纯化，其纯度是相对的，不可能象某些成分那么单纯。这里的纯化仅是得到相对分子量在某一范围里较为均一的多糖。 对于分子量较大的多糖，选择的sephadexG类对应的凝胶型号一般为sephadex G‐100、sephadex G‐150、sephadex G‐200，这些都属于比较软的一些凝胶（其中sephadex G‐200由于太软已经停止生产），这时，可以考虑用CellufineGCL‐2000代替，此填料的基材为纤维素，机械强度好，且它的分子量范围较宽，比较适合多糖的分离。 实验流程： 浓缩液--离心--醇析--DEAE‐52 纤维素--Sephadex G‐200 凝胶层析--多糖含量的测定--多糖组分纯度检测 |
3楼2012-11-06 00:31:13
【答案】应助回帖
hsd3521: 应助指数+1 2012-11-14 21:44:39
| 接下来要怎么做，主要还是要看你的实验是怎么设计的，如果你要做结构表征，那么你就要像3楼的那样，继续过两个柱子（一般是离子交换柱和凝胶柱），包括要透析、脱色、浓缩结晶什么的，从而得到高纯度的多糖组分，此步较为繁琐，制取周期长，量也少。得到的所谓的多糖纯品，还到底纯度怎么样？是需要实验证实的。那么接下来就是需要对多糖纯度鉴定：最简单的方法就是去跑高效液相，当然如果条件限制的话，你可以做聚丙烯酰胺电泳、薄层板、琼脂糖电泳、气相色谱也可以（需要衍生化）等等，纯度鉴定为高纯度纯品之后，你就可以用你的纯品做结构表征了，主要包括：分子量分布情况、碳架结构、单糖组分及比例、基团等，这些你需要用到一些高技术仪器，譬如：高效液相、气相、紫外、红外、质谱、原子吸收、核磁共振等等。主要是四大光谱的性质。如果你能来很强的话，可以做这些，把多糖的一级结构做个大概预测。如果你要做活性的话，那么有两种情况：一是用粗糖去做，二是用精多糖来做（困难很大）。当然也包括你是做体内的还是体外的活性，也要看你实验是怎么设计的。如果以上你都做了，那就写成英文的，你就直接发SCI吧。呵呵。祝你实验愉快啊。 |
4楼2012-11-14 15:59:06
