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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 食品 » 碳水化合物 » 与多糖相关的前辈们帮帮忙啊
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2320

金虫 (正式写手)

善变小鬼

[求助] 与多糖相关的前辈们帮帮忙啊

本人做多糖提取的相关实验，现在已经提到了粗多糖，接下来该怎么办呢？老师说让先在薄层板上跑板，他说的什么意思啊？
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简单的快乐着；简单的幸福着；简单的努力着。加油！
1楼 2012-11-05 15:40:29
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小毛孩24

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
薄层板可以分离初步推断一些小分子糖，大分子多糖基本不会迁移。
得到粗多糖，下面就是确定有没有糖蛋白，过柱子将各组分分开，做基本理化性质，单糖组成什么的。。。到最后做活性
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2楼2012-11-05 22:46:52
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dongle320

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
2320: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢您的帮助！ 2012-11-06 10:17:53
你只做了提取得到了一个混合物接下来要纯化
1、脱蛋白和色素。
2、色谱柱纯化
3、分子量测定
4、结构确定
一、提取
样品处理：洗净，晾干、磨碎、过筛( 80 目)
1、热水提法
料液比＝1∶（20-30）有报道1:30最好，90℃时浸提2h，反复浸提2次，5000r／min离心15min，残渣水洗后重复离心一次，合并上清液，经减压浓缩(60℃)。
2、稀酸提法
在60-70℃用料液比1∶20、pH 2。0.17mol/L-HCl（pH＝2） 的稀盐酸提取两次，每次2h，离心，合并上清液用碱（NaOH）中和。
以上两个方法可以辅助超声波。辅助条件：物料比为1：30，提取时间为30min，温度为60-70℃，pH为7．超声波频率以低频好，高频率会使多糖分子断裂。
二、脱蛋白分离多糖
根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用V（氯仿）∶V（戊醇或正丁醇）为5∶1或4∶1（滤液:氯仿：正丁醇=25：（4、5）：1），混合物剧烈振摇20～30min，蛋白质变性生成凝胶，离心分离，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质.此种只能除去少量蛋白质，效率不高，须反复多次，多糖有损失.但此方法比较温和，在避免多糖降解上效果较好，如配合加入一些蛋白质水解酶，用Sevage法效果更佳。Sevage 法和酶法联用除蛋白即先添加0.1%的木瓜蛋白酶，在pH 6.5、50℃条件下酶解2h，再用Sevage 法反复脱蛋白6 次，直到中间层无沉淀产生为止，收集上层液，透析( 透析袋截留相对分子质量3000u) 截留液减压浓缩，加乙醇（3倍体积95%乙醇）至浓度为70%，静置沉淀。生成沉淀经丙酮、乙醚、无水乙醇依次洗涤（可除去色素），真空冷冻干燥得粗多糖。
注：除褐藻酸：取上述粗多糖溶解于蒸馏水中，加入终浓度为0.05mol /L 的CaCl2和20% 的乙醇，室温放置过夜使沉淀完全， 3000r /min 离心20min，弃去粗多糖中的褐藻酸钙沉淀。
三、纯化
1、纤维素阴离子交换柱层析DEAE‐cellulose
最常见的交换剂为DEAE－纤维素（硼酸型或碱型），洗脱剂可用不同浓度的碱溶液、硼砂溶液、盐溶液等。此方法目前最为常用。它一方面可纯化多糖，另一方面还适于分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖。
多糖溶液加入DEAE－52层析柱上端，分别用浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mol /L NaCl 溶液进行梯度洗脱，流速为1.0mL /min，以6mL /管进行样品收集。苯酚－硫酸法在480nm 处跟踪检测吸光度，绘制洗脱曲线，透析、浓缩、冷冻干燥，可以得到不同分子量的多糖。
2、凝胶柱层析
根据多糖分子的大小和形状不同进行分离。常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)及琼脂糖凝胶(Sepharose)。多糖分离时多选用Sephadex G—50以分离相对分子量在1万以下的各组分，然后选用Sephadex G-150-200进一步纯化。展层剂为各种浓度的盐溶液及缓冲液，一般用0．1mol／L NaCl。 (20×430mm)，用苯酚—硫酸法进行检测，收集糖反应阳性高峰部分，醇沉，干燥，即得纯化的多糖。
要注意的是，对多糖的纯化，其纯度是相对的，不可能象某些成分那么单纯。这里的纯化仅是得到相对分子量在某一范围里较为均一的多糖。
对于分子量较大的多糖，选择的sephadexG类对应的凝胶型号一般为sephadex G‐100、sephadex G‐150、sephadex G‐200，这些都属于比较软的一些凝胶（其中sephadex G‐200由于太软已经停止生产），这时，可以考虑用CellufineGCL‐2000代替，此填料的基材为纤维素，机械强度好，且它的分子量范围较宽，比较适合多糖的分离。
实验流程：
浓缩液--离心--醇析--DEAE‐52 纤维素--Sephadex G‐200 凝胶层析--多糖含量的测定--多糖组分纯度检测
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3楼2012-11-06 00:31:13
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lezai945

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

hsd3521: 应助指数+1 2012-11-14 21:44:39
接下来要怎么做，主要还是要看你的实验是怎么设计的，如果你要做结构表征，那么你就要像3楼的那样，继续过两个柱子（一般是离子交换柱和凝胶柱），包括要透析、脱色、浓缩结晶什么的，从而得到高纯度的多糖组分，此步较为繁琐，制取周期长，量也少。得到的所谓的多糖纯品，还到底纯度怎么样？是需要实验证实的。那么接下来就是需要对多糖纯度鉴定：最简单的方法就是去跑高效液相，当然如果条件限制的话，你可以做聚丙烯酰胺电泳、薄层板、琼脂糖电泳、气相色谱也可以（需要衍生化）等等，纯度鉴定为高纯度纯品之后，你就可以用你的纯品做结构表征了，主要包括：分子量分布情况、碳架结构、单糖组分及比例、基团等，这些你需要用到一些高技术仪器，譬如：高效液相、气相、紫外、红外、质谱、原子吸收、核磁共振等等。主要是四大光谱的性质。如果你能来很强的话，可以做这些，把多糖的一级结构做个大概预测。如果你要做活性的话，那么有两种情况：一是用粗糖去做，二是用精多糖来做（困难很大）。当然也包括你是做体内的还是体外的活性，也要看你实验是怎么设计的。如果以上你都做了，那就写成英文的，你就直接发SCI吧。呵呵。祝你实验愉快啊。
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4楼2012-11-14 15:59:06
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prtong

金虫 (正式写手)
你好，请问你用sevage法除蛋白的时候，一般是怎么去除水层和溶剂层的蛋白沉淀的？我做过一下发现中间的这些沉淀除起来比较费劲，有时候会损失一些多糖，有时候又容易把蛋白又留下了！
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5楼2013-04-06 21:12:32
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2320

金虫 (正式写手)

善变小鬼
引用回帖:
5楼: Originally posted by prtong at 2013-04-06 21:12:32
你好，请问你用sevage法除蛋白的时候，一般是怎么去除水层和溶剂层的蛋白沉淀的？我做过一下发现中间的这些沉淀除起来比较费劲，有时候会损失一些多糖，有时候又容易把蛋白又留下了！

我的量比较小，用的是分液漏斗。多一个步骤就多一点损失！
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6楼2013-04-08 08:41:37
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prtong

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 2320 at 2013-04-08 08:41:37
我的量比较小，用的是分液漏斗。多一个步骤就多一点损失！...

哦，谢谢！不过不知道沉淀多了会不会堵塞分液漏斗，或者沉淀粘在漏斗壁上，当倒上层液的时候会一起倒出来！
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7楼2013-04-08 09:26:48
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zcczj

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by prtong at 2013-04-08 09:26:48
哦，谢谢！不过不知道沉淀多了会不会堵塞分液漏斗，或者沉淀粘在漏斗壁上，当倒上层液的时候会一起倒出来！...

用分液漏斗怎么倒上层呢，变性蛋白是在分界面和下层的，所以只用放下来就行
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慢慢的……
8楼2013-04-11 12:21:19
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prtong

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zcczj at 2013-04-11 12:21:19
用分液漏斗怎么倒上层呢，变性蛋白是在分界面和下层的，所以只用放下来就行...

是的，氯仿和沉淀从下面出来，多糖溶液肯定要从上面倒出来！不过倒出来的时候还好，就是时间要多静置一会！谢谢了噶！
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9楼2013-04-11 13:52:51
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lingshu

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by prtong at 2013-04-06 21:12:32
你好，请问你用sevage法除蛋白的时候，一般是怎么去除水层和溶剂层的蛋白沉淀的？我做过一下发现中间的这些沉淀除起来比较费劲，有时候会损失一些多糖，有时候又容易把蛋白又留下了！

楼主试过离心么
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10楼2013-04-30 23:29:40
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